AEG-1和Endoglin在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其意義

陳海倫 羅幸波 宏小翠

[摘要] 目的 探討星形細胞上調(diào)基因-1（Astrocyte elevated gene-1，AEG-1）和Endoglin標(biāo)記的微血管密度計數(shù)（MVD）在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及兩者與臨床病理特征間的關(guān)系。 方法 收集惠州市中心人民醫(yī)院和廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2014年1月～2018年3月20例正常子宮內(nèi)膜組織、43例子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化法檢測AEG-1和Endoglin標(biāo)記的MVD表達情況。 結(jié)果 在正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織中，AEG-1的陽性表達率呈逐漸上升趨勢（P<0.01），AEG-1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達水平與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤深度、組織學(xué)分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P<0.05）;在正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織中，Endoglin標(biāo)記的MVD表達強度呈逐漸上升趨勢（P<0.01），Endoglin標(biāo)記的MVD在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達強度與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤深度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論 子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1和Endoglin呈高表達，提示AEG-1和Endoglin在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，AEG-1和Endoglin表達水平的檢測可用于子宮內(nèi)膜癌的輔助診斷和病情估計。

[關(guān)鍵詞] AEG-1;Endoglin;子宮內(nèi)膜癌;免疫組化法

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖道三大常見惡性腫瘤之一，約占女性癌癥總數(shù)的7%，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，全球子宮內(nèi)膜癌患者的數(shù)量逐年增加，呈年輕化趨勢，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生是多基因、多步驟、多階段等相互作用的結(jié)果，涉及癌基因的激活與腫瘤新生血管的生成[1-4];星形細胞上調(diào)基因-1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）是近年來新發(fā)現(xiàn)的癌基因，又稱之為異黏蛋白（Metadherin，MTDH）、3D3，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[5-8];Endoglin亦命名為CD105，研究表明腫瘤組織及其轉(zhuǎn)移病灶中新生血管內(nèi)皮細胞可產(chǎn)生Endoglin，Endoglin與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[9-12]。本研究采用免疫組化法檢測AEG-1及Endoglin標(biāo)記的微血管密度計數(shù)（Microvessel density，MVD）在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達情況，探討AEG-1和Endoglin與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集惠州市中心人民醫(yī)院和廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2014年1月～2018年3月住院手術(shù)或門診活檢病理標(biāo)本63例，其中正常子宮內(nèi)膜組織共20例，子宮內(nèi)膜癌組織共43例，子宮內(nèi)膜癌按FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)進行相應(yīng)分期，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期17例，Ⅳ期5例;低分化19例、中分化11例，高分化13例;所有子宮內(nèi)膜癌病例術(shù)前均未行化療、放療或免疫治療，各組之間年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;兔抗人AEG-1單克隆抗體和鼠抗人Endoglin單克隆抗體購自美國Abcam公司，即用型免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 免疫組化檢測方法

石蠟包埋組織以4 μm厚度行連續(xù)切片，常規(guī)給予脫蠟至水化程度，切片浸于50 mmol/L（pH 8.0）乙二胺四乙酸溶液之中，予微波抗原修復(fù)10 min，冷卻到室溫狀態(tài)，給予充分水洗，PBS浸洗，滴加正常山羊血清封閉液之中，室溫20 min;甩去掉多余液體，不予洗滌，加入AEG-1單抗或Endoglin單抗4℃溫度過夜;給予PBS洗滌;滴加于SP 9000通用生物素標(biāo)記二抗，37℃，40 min;予二氨基聯(lián)苯氨顯色30 s，給予蘇木素復(fù)染，乙醇脫水、透明及中性樹膠封固。二氨基聯(lián)苯氨顯色液配制步驟：取DAB 5 mg溶于100 mL 0.05mol/L Tris-鹽酸（pH7.6）當(dāng)中，加入30%過氧化氫10 μL，攪拌混勻后給予過濾（使用前給予新配制）;采用該公司配套提供的陽性切片作為陽性對照，使用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 陽性結(jié)果判定

AEG-1以胞漿或胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒作為陽性細胞。按半定量積分法來判斷表達情況，根據(jù)染色強度及陽性細胞所占比例分別標(biāo)記為0～3分。染色強度：未著色標(biāo)記為0分，著色淺標(biāo)記為1分，中度著色標(biāo)記為2分，著色深標(biāo)記為3分。陽性細胞百分率：高倍鏡（×400）下隨機選取10個視野，每個視野共計數(shù)100個細胞。計算平均陽性百分率，平均陽性細胞百分率≥5%為陽性。

Endoglin標(biāo)記的MVD計數(shù)方法：首先在低倍鏡下全面仔細觀察切片以便確定腫瘤內(nèi)血管密度的最高處，即為熱點處;再在高倍鏡（0.189 mm2/視野）下，以與周圍腫瘤細胞及結(jié)締組織成分可明顯區(qū)別的任何一個棕色染色的內(nèi)皮細胞或細胞叢維的一個血管，只要結(jié)構(gòu)不是相連接，其分支結(jié)構(gòu)亦作為一個血管計數(shù);記錄3個視野當(dāng)內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均數(shù)作為患者的MVD值，雙盲分析其結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件分析，計數(shù)資料各組之間差異采用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，各組之間差異采用t 檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AEG-1在正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織中的表達狀態(tài)

正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1的陽性表達率分別為25.00%（5/20）、65.12%（28/43），子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1的陽性表達率高于正常子宮內(nèi)膜組織的陽性表達率，兩組之間表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.8073，P<0.01）（表1）。

2.2 AEG-1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系

結(jié)果表明AEG-1表達水平與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤深度、組織學(xué)分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P<0.05）（表2）。

2.3 Endoglin標(biāo)記的MVD在正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織中的表達強度

正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織中Endoglin標(biāo)記MVD的表達強度分別為（16.5375±2.1097）、（39.4337±7.8475），子宮內(nèi)膜癌組織中Endoglin標(biāo)記MVD的表達強度高于正常子宮內(nèi)膜組織的表達強度，兩組間表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t′=17.7993，P<0.01）（表3）。

2.4 Endoglin標(biāo)記的MVD在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達強度與臨床病理因素特征之間關(guān)系

結(jié)果表明Endoglin標(biāo)記的MVD表達強度與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤深度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P<0.05）（表4）。

3討論

AEG-1基因是腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)或人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）感染人胚胎星形細胞后導(dǎo)致表達升高的一種基因，近年來研究證實AEG-1在多種腫瘤組織中呈過表達，并在增強細胞的致瘤能力、促進腫瘤細胞的增殖分化、增強腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移、促進腫瘤新生血管的生成以及介導(dǎo)化療耐藥等方面均發(fā)揮著十分重要的作用[13-15];Lee等[16]研究結(jié)果表明：高表達的AEG-1基因還能夠通過促進人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的非錨定依賴性生成，最終可導(dǎo)致腫瘤細胞入侵及轉(zhuǎn)移的能力增強;孫利波等[17]比較AEG-1基因mRNA在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達狀況，實時熒光定量PCR檢測時發(fā)現(xiàn)，在mRNA水平，正常腦組織中AEG-1基因的表達明顯低于膠質(zhì)瘤組織，并且Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中AEG-1的陽性表達率明顯高于Ⅰ～Ⅱ級，研究得出結(jié)論：在膠質(zhì)瘤組織中AEG-1基因mRNA和蛋白明顯呈高表達，并且其表達水平和膠質(zhì)瘤腫瘤惡性程度呈正相關(guān)，其可能是膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的一個惡性標(biāo)志物;甘梅富等[18]研究結(jié)果表明：結(jié)直腸癌組織中的AEG-1表達水平明顯高于結(jié)直腸癌癌旁組織，且在癌組織中AEG-1表達水平與結(jié)直腸癌TNM分期、組織學(xué)分級、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān);本研究結(jié)果表明AEG-1在正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達陽性率依次增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，隨肌層浸潤深度增大、FIGO分期增高，AEG-1表達陽性率亦增高;低分化者AEG-1表達陽性率明顯高于高、中分化者;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者AEG-1表達陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者;提示AEG-1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達水平與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤深度、組織學(xué)分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，AEG-1作為腫瘤癌基因，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起一定程度的作用。

Endoglin是一種同型二聚體的膜結(jié)合糖蛋白，位于染色體9q34，分子量為180 kD，Endoglin在多種腫瘤組織的內(nèi)皮細胞當(dāng)中特異性高表達，與細胞增殖指標(biāo)Ki67、CyclinA的表達明顯相關(guān)，是內(nèi)皮細胞增殖的關(guān)聯(lián)標(biāo)記物，能夠定量性區(qū)別已存在血管和腫瘤新生血管，多因素分析結(jié)果顯示用Endoglin測定的MVD可作為惡性腫瘤一個獨立的預(yù)后指標(biāo)[19-20];梁啟廉等[21]通過動物模型進行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)抗Endoglin單抗可以顯著抑制人胰腺癌PC-3細胞株的生長，最高抑瘤率可達67.13%，抗Endoglin單抗有可能成為胰腺癌的基因工程治療方法之一;Ho等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Endoglin標(biāo)記的MVD表達強度越高預(yù)示肝癌侵襲程度更高，癌旁非腫瘤組織的Endoglin表達可以預(yù)測早期復(fù)發(fā);本研究結(jié)果表明隨著正常子宮內(nèi)膜組織→子宮內(nèi)膜癌的過程，Endoglin標(biāo)記的MVD表達強度顯示依次增加，隨肌層浸潤深度增大、FIGO分期增高，Endoglin標(biāo)記的MVD表達強度亦隨之增加，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示Endoglin標(biāo)記的MVD與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤深度、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān);上述結(jié)果表明子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1和Endoglin呈高表達，提示AEG-1和Endoglin在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中有著重要的作用，AEG-1和Endoglin表達水平的檢測可用于子宮內(nèi)膜癌的輔助診斷和病情評估。

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