決明子低聚糖提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化研究及其組分分析

賈志飛，蔡為榮

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

決明子(Cassia seed)又名馬蹄子、草決明，是一種藥食同源的原料，屬豆科植物決明(CassiaobtusifoliaL.)或小決明(C.toraL.)的成熟干燥種子[1]。決明子味苦、甘、咸，性微寒，入肝、腎、大腸經(jīng)，以具有明目之功而得名[2]。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，決明子“治青盲，久服益精光”。它在長(zhǎng)江以南地區(qū)均有種植或野生，主產(chǎn)于安徽、浙江、四川、廣東、廣西等地[3]。

現(xiàn)代研究表明，決明子含有許多對(duì)人體有益的成分，諸如蒽醌類、萘并-吡喃-酮類、糖類、蛋白質(zhì)及氨基酸類、微量元素等[4]，具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑菌等作用[5]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)決明子中的物質(zhì)和成分做了一定的研究，但大多集中在蒽醌類、多糖、降脂降壓作用的研究以及功能性飲料的開(kāi)發(fā)上[6]，對(duì)其中的低聚糖的研究相對(duì)較少。低聚糖能夠促進(jìn)人體腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖[7]，對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體健康水平具有重要作用，因此對(duì)決明子中低聚糖的研究具有很高的價(jià)值。

低聚糖的提取方法主要有水浴提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法及酶法制備等[8]，但是目前對(duì)決明子中低聚糖的提取工藝研究鮮有報(bào)道。因此，采用水浴醇提的方法對(duì)決明子低聚糖進(jìn)行提取，通過(guò)響應(yīng)面分析得到?jīng)Q明子低聚糖的提取工藝，使用高效凝膠滲透色譜法、離子色譜法及紅外光譜法對(duì)低聚糖的組分進(jìn)行了初步分析，為深入研究決明子低聚糖提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

決明子，產(chǎn)于安徽亳州；無(wú)水乙醇(AR)、濃硫酸(AR)、苯酚(AR)、CHCl3(AR)、正丁醇(AR)、葡萄糖(AR)等，均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司試劑；蒸餾水。

1.2 主要儀器

HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；JY1002電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)；722紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)SIM公司)；IRPretige-21傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(3)低聚糖含量的測(cè)定：決明子低聚糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[11]。

(4)單因素實(shí)驗(yàn)：分別考察提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度及料液比4個(gè)因素對(duì)決明子低聚糖得率的影響。準(zhǔn)確稱取干燥粉碎后的決明子樣品10 g于250 mL三角瓶中，利用水浴醇提的方法，在提取時(shí)間90 min，料液比1∶20(g/mL)，乙醇濃度20%的條件下，考察溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)對(duì)決明子低聚糖得率的影響。在提取溫度50 ℃，提取時(shí)間90 min，料液比1∶20(g/mL)的條件下，考察乙醇濃度(0、10%、20%、30%、40%)對(duì)決明子低聚糖得率的影響。在提取溫度50℃，提取時(shí)間90min，乙醇濃度20%的條件下，考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)(g/mL)對(duì)決明子低聚糖得率的影響。在提取溫度50 ℃，料液比1∶20(g/mL)，乙醇濃度20%的條件下，考察提取時(shí)間(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)對(duì)決明子低聚糖得率的影響。

(5)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)：依據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken原理采用四因素三水平的方法設(shè)計(jì)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用該軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果最終確定決明子低聚糖的最佳提取條件，并在該條件下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目尚行浴?/p>

(6)決明子低聚糖的組分分離：將經(jīng)Sevag法脫蛋白后的低聚糖溶液分別于500 Da、1 000 Da和2 000 Da截留規(guī)格的透析袋中透析36h后收集其組分進(jìn)行真空冷凍干燥。

(7)分子量的測(cè)定：將制得的低聚糖樣品溶解于流動(dòng)相中，經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測(cè)定其分子量。色譜條件(色譜柱：Ultra hydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mmid×2，流動(dòng)相：0.1 MNaNO3，流速：0.9 mL/min，柱溫：45 ℃。)

(8)單糖組成分析：采用ICS-5000離子色譜儀(美國(guó)戴安公司)對(duì)決明子低聚糖進(jìn)行單糖組成分析。色譜柱：CarboPac PA20；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器。

(9)紅外光譜分析：取1 mg左右真空冷凍干燥后的決明子低聚糖樣品與100～200 mg充分干燥后的KBr于瑪瑙研缽中研磨成細(xì)粉，經(jīng)壓片機(jī)壓片后用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定，掃描波長(zhǎng)為400～4 000 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)提取溫度對(duì)決明子低聚糖得率的影響。在提取時(shí)間90 min，乙醇濃度20%，料液比1∶20(g/mL)的條件下，考察了提取溫度對(duì)決明子低聚糖得率的影響，具體如圖1所示。由圖1可知，決明子低聚糖的得率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在溫度低于50 ℃時(shí)，低聚糖得率隨溫度的提升而逐漸提高，在溫度高于50 ℃時(shí)，低聚糖得率隨溫度的提升而逐漸下降。可能的原因是，在溫度較低時(shí)，溫度的增加能夠加快低聚糖的擴(kuò)散，促進(jìn)細(xì)胞中物質(zhì)的溶出，因而低聚糖的得率也隨之提升，而在溫度過(guò)高時(shí)，不僅會(huì)對(duì)低聚糖造成破壞，還有可能引起細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的變性，影響低聚糖的溶出，從而使低聚糖的得率下降[12]。因此，選擇決明子低聚糖提取的溫度為50 ℃。

(2)提取時(shí)間對(duì)決明子低聚糖得率的影響。在提取溫度50 ℃，乙醇濃度20%，液料比1∶20(g/mL)的條件下，考察了提取時(shí)間對(duì)決明子低聚糖得率的影響，具體如圖2所示。從圖2中可以看出，決明子低聚糖的得率隨著提取時(shí)間的增加而逐漸提高，而在提取時(shí)間90 min后，低聚糖得率的提升幅度并不明顯，由增加提取時(shí)間帶來(lái)的收益并不顯著，出于節(jié)約時(shí)間及能源的考慮，設(shè)定提取時(shí)間90 min為決明子低聚糖提取的最佳時(shí)間條件。

圖1 提取溫度對(duì)決明子低聚糖得率的影響 圖2 提取時(shí)間對(duì)決明子低聚糖得率的影響

(3)乙醇濃度對(duì)決明子低聚糖得率的影響。在提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為90 min，料液比為1∶20(g/mL)的條件下，考察了乙醇濃度對(duì)決明子低聚糖得率的影響，具體如圖3所示。由圖3可知，決明子低聚糖的得率隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是，低聚糖在不同濃度的乙醇溶液中溶解度有所不同，而且在乙醇濃度較低時(shí)，少量乙醇的存在加速了決明子組織中有機(jī)物質(zhì)的溶解，促使低聚糖等物質(zhì)溶出胞外，增加了低聚糖的得率，而隨著乙醇濃度的進(jìn)一步提高，過(guò)高的乙醇濃度可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的緊致作用，濃度越高，這種作用越強(qiáng)，從而抑制了低聚糖的溶出[13]。因此，選擇決明子低聚糖提取的乙醇濃度為20%。

(4)料液比對(duì)決明子低聚糖得率的影響。在提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為90 min，乙醇濃度為20%的條件下，考察了料液比對(duì)決明子低聚糖得率的影響，具體如圖4所示。從圖4中可以看出，在料液比1∶20(g/mL)之前，低聚糖得率明顯提升，在料液比1∶20(g/mL)之后，低聚糖得率呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)?？赡苁怯捎谠谳^高的料液比時(shí)，溶劑的量較少，物質(zhì)的溶解擴(kuò)散緩慢，不利于決明子中物質(zhì)的溶解溶出，從而使低聚糖的得率較低。而隨著料液比的降低，溶劑的用量增加，使得物質(zhì)的溶解溶出加快，增加了低聚糖的得率，但是由于大量溶劑的使用，在制備及收集的工藝過(guò)程中，原料的損耗也隨之增加，于是出現(xiàn)低聚糖得率小幅降低的趨勢(shì)。因此，決明子低聚糖提取的最佳料液比條件為1∶20(g/mL)。

圖3 乙醇濃度對(duì)決明子低聚糖得率的影響 圖4 料液比對(duì)決明子低聚糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬定了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)為提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度及料液比的四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，四因素經(jīng)過(guò)擬合得到多元回歸方程：

低聚糖得率=+10.85+0.10×A+0.17×B+1.06×C+0.25×D+0.014×AB-0.084×AC-0.056×AD-0.027×BC+0.070×BD+0.17×CD-0.89×A2-0.32×B2-1.06×C2-0.77×D2。

決明子低聚糖提取Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出，響應(yīng)面設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)號(hào)分為兩種，其中1～24號(hào)為析因?qū)嶒?yàn)，25～29號(hào)為中心實(shí)驗(yàn)。由Design-Expert軟件進(jìn)行的ANOVA分析結(jié)果如表3所示。

綜合表3中數(shù)據(jù)，回歸方程中各因素及其組合對(duì)響應(yīng)值的影響可由其顯著性即P值來(lái)判斷，P值越小其顯著程度越高。由表3可看出該模型的P值小于0.01，達(dá)到了極顯著的水平。失擬項(xiàng)P值大于0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著。在這種情況下，因素D和B2達(dá)到了顯著水平，因素C、A2、C2和D2達(dá)到了極顯著水平。方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.945 5，說(shuō)明94.55%的數(shù)據(jù)可以用此模型來(lái)解釋，該方程的模型具有較高的擬合度。根據(jù)響應(yīng)面的坡度及等高線的形狀可以看出每個(gè)因素對(duì)低聚糖得率影響的強(qiáng)弱及因素間交互作用的顯著程度[14]。在各因素水平范圍內(nèi)，其對(duì)低聚糖得率的影響由大到小依次為：料液比(C)、提取溫度(A)、提取時(shí)間(D)、乙醇濃度(B)。各因素間交互影響的響應(yīng)面及等高線圖如圖5所示。

表1 決明子低聚糖提取Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

因素水平-101A提取溫度/℃405060B提取時(shí)間/min6090120

因素水平-101C料液比/g·mL-11∶101∶201∶30D乙醇濃度/%102030

表2 決明子低聚糖提取Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

實(shí)驗(yàn)號(hào)A:溫度/℃B:時(shí)間/minC:料液比/g·mL-1D:乙醇濃度/%得率/mg·g-11-1-1009.19821-1009.5523-11009.8324110010.241500-1-17.6366001-19.583700-118.2228001110.8539-100-19.20110100-19.20611-10019.2561210019.037130-1-108.1211401-108.278150-11010.676

實(shí)驗(yàn)號(hào)A:溫度/℃B:時(shí)間/minC:料液比/g·mL-1D:乙醇濃度/%得率/mg·g-116011010.72517-10-107.8071810-108.31419-10109.5562010109.728210-10-19.32222010-19.467230-1019.82224010110.24725000010.89626000011.01127000010.88628000011.00329000010.442

表3 響應(yīng)面ANOVA分析結(jié)果

注：*表示顯著(P﹤0.05)，**表示極顯著(P﹤0.01)

圖5 各因素交互影響低聚糖得率的響應(yīng)面及等高線圖

根據(jù)Design-Expert軟件對(duì)擬合的二次回歸方程求最大值可得，決明子低聚糖提取的最佳工藝條件為：提取溫度50.29 ℃，提取時(shí)間98.44 min，料液比1∶25.12(g/mL)，乙醇濃度22.32%，在此條件下決明子低聚糖的理論預(yù)測(cè)得率為11.175 mg/g?？紤]到實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作及便利性，故而修正最佳工藝條件為：提取溫度50 ℃，提取時(shí)間100 min，料液比1∶25(g/mL)，乙醇濃度22%。以此條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的低聚糖得率分別為11.131 mg/g、11.165 mg/g、11.157 mg/g，計(jì)算平均得率為11.151 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值11.175 mg/g接近，說(shuō)明采用Box-Behnken作為響應(yīng)面模型能較好地預(yù)測(cè)決明子低聚糖的實(shí)際提取效果，具有一定的可行性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 決明子低聚糖的分子量分析

通過(guò)500 Da、1 000 Da和2 000 Da 3種規(guī)格的透析袋透析36 h后得到3種決明子低聚糖組分，分別命名為COSA、COSB和COSC。3種組分通過(guò)HPGPC的檢測(cè)結(jié)果如圖6、圖7、圖8所示。

圖6 決明子低聚糖組分COSA分子量色譜圖 圖7 決明子低聚糖組分COSB分子量色譜圖

圖8 決明子低聚糖組分COSC分子量色譜圖

3種決明子低聚糖組分COSA、COSB和COSC的重均分子量Mw分別為593、1 112和4 036，數(shù)均分子量Mn分別為405、965和2 399，其中Mw/Mn的值表示聚合物分子量的多分散性(PD)，其數(shù)值越接近1表明分子量分布越均勻，物質(zhì)越單一，反之則表明物質(zhì)分子量分布寬泛，物質(zhì)不均勻。由檢測(cè)結(jié)果計(jì)算可知COSA、COSB和COSC的PD值分別為1.46、1.15、1.68，表明相對(duì)于COSC來(lái)說(shuō)，COSA和COSB的分子量分布較為集中，物質(zhì)純度較高，而COSC則分子量分布寬，物質(zhì)純度較低。同時(shí)也說(shuō)明，采用透析的方法能較好地將決明子低聚糖中不同分子量大小的組分進(jìn)行分離。

2.4 單糖組成分析

以Fucose、Rhamnose、Arabinose、Galactose、Glucose、Xylose、Mannose、Fructose等8種單糖作為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)COSA、COSB及COSC中的單糖組成，檢測(cè)結(jié)果如圖9、圖10、圖11及表4所示。

從圖9、圖10、圖11中可以看出，COSA、COSB及COSC 3種決明子低聚糖組分均由4種單糖組成，分別為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖及葡萄糖，其中組分COSA中4種單糖組成的摩爾百分比分別為0.46%、3.28%、56.95%和39.31%，組分COSB中4種單糖組成摩爾百分比分別為0.48%、3.64%、50.31%和45.57%，組分COSC中4種單糖組成摩爾百分比分別為0.24%、1.91%、55.07%和42.78%。由表4可知，3個(gè)組分中單糖組成占比最高的是半乳糖，均在50%以上。其次是葡萄糖，兩者共占比在95%以上，是決明子低聚糖單糖組成的主要組分。鼠李糖和阿拉伯糖含量較少，其中以鼠李糖含量最少。半乳糖含量從高到低的組分依次是COSA>COSC>COSB；葡萄糖含量從高到低的組分依次是COSB>COSC>COSA。由此可知，決明子低聚糖的3個(gè)組分COSA、COSB和COSC的組成單糖種類相同，含量不同。同時(shí)可知，決明子低聚糖是以半乳糖和葡萄糖為主要單糖組成的低聚糖。

圖9 決明子低聚糖組分COSA離子色譜圖 圖10 決明子低聚糖組分COSB離子色譜圖

圖11 決明子低聚糖組分COSC離子色譜圖

表4 決明子低聚糖各組分單糖組成

組分單糖組成/摩爾百分比,%鼠李糖阿拉伯糖半乳糖葡萄糖COSA0.463.2856.9539.31COSB0.483.6450.3145.57

組分單糖組成/摩爾百分比,%鼠李糖阿拉伯糖半乳糖葡萄糖COSC0.241.9155.0742.78

2.5 紅外光譜分析

由3 000～2 800 cm-1的C-H伸縮振動(dòng)和1 400～1 200 cm-1的C-H變角振動(dòng)兩組糖類特征峰，可以確定此化合物為糖類化合物[15]。

決明子低聚糖組分紅外光譜圖如圖12所示。決明子低聚糖組分的紅外光譜分析如表5所示。對(duì)于呋喃環(huán)糖類化合物而言，937 cm-1、877 cm-1及818 cm-13個(gè)峰為呋喃環(huán)特征峰，結(jié)合圖12可知該糖類化合物并不符合呋喃型的特征。同時(shí)，吡喃環(huán)的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)所造成的C-O-C骨架振動(dòng)也在875 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰，而α-D-葡萄吡喃糖類化合物中的這個(gè)峰相對(duì)于β-型是比較強(qiáng)的。半乳吡喃糖在875 cm-1附近同樣會(huì)有吸收峰，這是由C2和C4位上赤道鍵構(gòu)型的C-H變角振動(dòng)所造成的。故而可以判斷該低聚糖為吡喃型。結(jié)合單糖組成的分析可以推斷，3種決明子低聚糖組分主要是由α-D-吡喃半乳糖和α-D-吡喃葡萄糖組成。

圖12 決明子低聚糖組分紅外光譜圖

表5 決明子低聚糖組分的紅外光譜分析

波長(zhǎng)/cm-1備注3600～3200此處的寬峰是糖類化合物O-H的伸縮振動(dòng),3425cm-1是糖類分子間氫鍵的吸收峰3000～2800糖類的特征吸收峰,2937cm-1為糖類化合物C-H的伸縮振動(dòng)1795糖類化合物C-H的伸縮振動(dòng)1650～1600此范圍為結(jié)晶水的吸收范圍,故1637cm-1為結(jié)晶水的吸收峰1400～1200此范圍吸收峰為糖類化合物C-H的變角振動(dòng)1200～1000此范圍吸收峰是糖類化合物C-O的伸縮振動(dòng),其中1149cm-1為C-O-H的伸縮振動(dòng),1090cm-1為C-O-C的伸縮振動(dòng)

3 結(jié)論

運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)決明子低聚糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到?jīng)Q明子低聚糖提取的最佳工藝為：提取溫度50 ℃，提取時(shí)間100 min，料液比1∶25(g/mL)，乙醇濃度22%，低聚糖的平均得率為11.151 mg/g。通過(guò)500 Da、1 000 Da和2 000 Da 3種規(guī)格的透析袋進(jìn)行組分分離得到數(shù)均分子量Mn分別為405 Da、965 Da及2 399 Da的3種組分。通過(guò)離子色譜分析可知，3種低聚糖組分的單糖組成種類相同而含量存在差異，且均以半乳糖和葡萄糖為主要單糖組成。結(jié)合紅外光譜分析可以初步推測(cè)，決明子低聚糖主要是以α-D-吡喃半乳糖和α-D-吡喃葡萄糖組成的低聚糖。研究結(jié)果為決明子低聚糖的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)，同時(shí)為其他植物低聚糖的提取研究提供了一定的參考。