子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2基因表達(dá)和臨床意義*

馬 莉，劉春喜，姚 麗

鄭州人民醫(yī)院 婦科(鄭州 450000)

子宮內(nèi)膜異位癥是婦科常見(jiàn)的一種具有功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)并生長(zhǎng)于正常位置以外部位的良性婦科疾病，但異位宮內(nèi)膜常發(fā)生病變，并累及盆腔、子宮肌層及卵巢等部位，進(jìn)而導(dǎo)致盆腔黏連、痛經(jīng)、慢性盆腔痛及不孕等癥狀[1]。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。研究[2]表明，子宮內(nèi)膜異位癥的子宮內(nèi)膜組織發(fā)生增殖并形成植入性病灶，且發(fā)病過(guò)程涉及黏附、侵襲及血管生成，病理過(guò)程與腫瘤組織的增殖及遷移等相似。目前，認(rèn)為細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)因子與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究[3]表明，DNA結(jié)合抑制因子2(inhibitor of differentiation/DNA binding 2，ID2)與腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移有關(guān)。富含脯氨酸/精氨酸的末端富含亮氨酸的重復(fù)蛋白(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein，PRELP)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖及遷移并參與其病變過(guò)程[4]。SPARC相關(guān)模塊化鈣結(jié)合蛋白2(SMOC2)主要在胚胎發(fā)育過(guò)程中高表達(dá)且可影響生長(zhǎng)因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生成及細(xì)胞增殖等多種細(xì)胞功能[5]。目前，關(guān)于ID2、PRELP及SMOC2在子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)研究相對(duì)較少，因此，本研究探討ID2、PRELP及SMOC2在患者子宮內(nèi)膜組織中的異常表達(dá)及其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年3月至2018年1月于鄭州人民醫(yī)院婦科診治的子宮內(nèi)膜異位癥患者102例為試驗(yàn)組，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)診斷為子宮內(nèi)膜異位癥患者。另以同期本院收治的98例子宮肌瘤患者為對(duì)照組，所有患者均接受子宮肌瘤切除術(shù)。試驗(yàn)組患者年齡32～67(45.64±5.23)歲，對(duì)照組年齡33～66(46.34±5.27)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與試驗(yàn)人員均知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合子宮內(nèi)膜異位癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；2)未接受過(guò)激素治療者；3)無(wú)其他嚴(yán)重性激素類疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)患有子宮內(nèi)膜腫瘤、子宮肌瘤等疾病者；2)嚴(yán)重肝腎功能障礙者；3)排除嚴(yán)重的內(nèi)分泌、呼吸、消化等系統(tǒng)疾?。?)臨床資料不全者。兩組患者年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.943，P=0.347)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測(cè)兩組子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2 mRNA表達(dá)量 術(shù)中分別切取子宮內(nèi)膜組織并留取兩份，第1份標(biāo)本用PBS緩沖液清洗后，儲(chǔ)存于液氮罐中，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)ID2、PRELP、SMOC2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。按照Trizol試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)ThermoFisher公司)合成cDNA。采用qRT-PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Mix 10 μL，cDNA 1 μL；ddH2O 8 μL；上下游引物各0.5 μL，均以β-actin為內(nèi)參引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)如下(表1)。反應(yīng)設(shè)置程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性1 min；95 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法對(duì)子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2蛋白表達(dá)情況 將1.2.1中留取的第2份子宮內(nèi)膜組織樣本進(jìn)行研磨，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解緩沖液中，提取各組子宮內(nèi)膜組織總蛋白并測(cè)定蛋白總量。采用Western blot法，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2蛋白水平，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，采用Tanon軟件拍攝圖像，并對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.3 檢測(cè)及觀察指標(biāo)

分別取兩組受試人員清晨空腹靜脈血5 mL并立即分為兩份，其中1份簡(jiǎn)單離心后，吸取上清，并采用酶聯(lián)免疫吸附法，按照檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)說(shuō)明書(shū)，測(cè)定血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。另1份樣品置于抗凝管內(nèi)，并加入白介素-1β(IL-1β)及癌抗原125(CA125)檢測(cè)試劑(上海普奧生物醫(yī)藥有限公司)，利用膠體金法檢測(cè)其表達(dá)水平。觀察兩組VEGF、TNF-α、IL-1β及CA125水平，并分析子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2表達(dá)與VEGF、TNF-α、IL-1β及CA125水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床指標(biāo)比較

試驗(yàn)組VEGF、TNF-α、IL-1β及CA125含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 兩組臨床指標(biāo)比較

2.2 兩組子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2 mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè)比較

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2 mRNA表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組ID2、PRELP、SMOC2蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)(表3～4、圖1)。

組別nID2/β-actinPRELP/β-actinSMOC2/β-actin對(duì)照組981.07±0.031.02±0.021.08±0.02試驗(yàn)組1022.43±0.322.74±0.542.04±0.52t41.89231.50818.261P<0.001<0.001<0.001

組別nID2/β-actinPRELP/β-actinSMOC2/β-actin對(duì)照組9849.76±7.6838.42±3.3442.27±3.79試驗(yàn)組10285.16±6.1788.97±15.6889.57±16.47t36.00531.23827.731P<0.001<0.001<0.001

圖1 Western blot法檢測(cè)兩組子宮內(nèi)膜組織中各蛋白表達(dá)水平

2.3 試驗(yàn)組子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

試驗(yàn)組患者子宮內(nèi)膜組織中ID2與VEGF、IL-1β及CA125呈正相關(guān)，PRELP與VEGF、TNF-α及CA125呈正相關(guān)，SMOC2與IL-1β及CA125呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表5)。

表5 試驗(yàn)組子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.4 ROC曲線分析ID2、PRELP、SMOC2對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的預(yù)判價(jià)值

ROC曲線分析顯示，子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2對(duì)臨床診斷子宮內(nèi)膜異位癥具有較高的預(yù)判價(jià)值，結(jié)果顯示，ID2的AUC面積為0.796，敏感性為86.34，特異性為64.10，截?cái)嘀禐?.66；PRELP的AUC面積為0.919，敏感性為92.41，特異性為82.05，截?cái)嘀禐?.10；SMOC2的AUC面積為0.818，敏感性為92.06，特異性為58.97，截?cái)嘀禐?.83(圖2、表6)。

圖2 ID2、PRELP、SMOC2的ROC分析圖

2.5 相關(guān)因素影響子宮內(nèi)膜異位的Logistic回歸分析

Logistic多元回歸分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP及SMOC2均為子宮內(nèi)膜異位癥患者的危險(xiǎn)因素(表7)。

表7 相關(guān)因素影響子宮內(nèi)膜異位的Logistic回歸分析

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥可使盆腔炎內(nèi)環(huán)境發(fā)生慢性炎癥改變，從而影響卵子存活，并導(dǎo)致患者不孕，其發(fā)生發(fā)展可以導(dǎo)致患者多種不良臨床結(jié)局的發(fā)生[7]。目前，臨床采用腹腔鏡手術(shù)去除肉眼可見(jiàn)的病變，但仍有部分患者不能懷孕。治療后疾病的病情進(jìn)展率較高，可能是其存在分子水平異常從而影響受孕及胚胎發(fā)育。研究[8]表明，細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)因子改變與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)，可通過(guò)影響異位癥子宮內(nèi)膜組織中的腺體細(xì)胞發(fā)生增殖及侵襲等生理過(guò)程，進(jìn)而加快腺體細(xì)胞的浸潤(rùn)過(guò)程，最終導(dǎo)致病情持續(xù)性惡化。因而，尋求特異性分子標(biāo)志物對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的診斷及治療均具有重要意義。研究[9]表明，ID2、PRELP及SMOC2與卵巢子宮內(nèi)膜瘤病變發(fā)生有關(guān)，且均可直接或間接參與細(xì)胞遷移、侵襲及血管生成等過(guò)程。關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥患者中ID2、PRELP及SMOC2表達(dá)研究相對(duì)較少，因此本研究主要探討ID2、PRELP及SMOC2在子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)水平，可為子宮內(nèi)膜異位癥患者的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

ID2是分化/DNA結(jié)合抑制因子家族的成員，其主要通過(guò)與堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成異源二聚體而導(dǎo)致ID2缺失，影響其與靶基因的結(jié)合，進(jìn)而抑制相關(guān)基因表達(dá)[10]。研究[11]表明，ID2異常表達(dá)可促進(jìn)癌癥細(xì)胞增殖及遷移，其與細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)糖基化、細(xì)胞侵襲及血管生成緊密相關(guān)。由于子宮內(nèi)膜異位癥與癌癥之間的相似性，本研究通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)試驗(yàn)組及正常組子宮內(nèi)膜組織中ID2 mRNA表達(dá)量，并采用Western blot法檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者ID2 mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，說(shuō)明子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜組織中ID2呈上調(diào)表達(dá)。觀察試驗(yàn)組子宮內(nèi)膜組織中ID2與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者子宮內(nèi)膜組織中ID2與VEGF、IL-1β及CA125呈正相關(guān)，其中VEGF高表達(dá)可增加異位癥腺體細(xì)胞的浸潤(rùn)能力[12]，IL-1β與CA125在子宮內(nèi)膜異位癥患者中高表達(dá)，并可通過(guò)損傷異位癥病灶組織中的線粒體而提高腺體細(xì)胞的黏附能力，最終嚴(yán)重?fù)p傷基底膜層上皮組織[13-14]。說(shuō)明ID2高表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥患者病情進(jìn)展緊密相關(guān)，推測(cè)子宮內(nèi)膜組織中ID2表達(dá)可作為預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥患者嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

PRELP在胰腺癌組織中高表達(dá)，其可與基底膜蛋白聚糖及膠原蛋白結(jié)合，進(jìn)而抑制相關(guān)基因表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲[15]。相關(guān)研究[16]表明，PRELP與新血管形成有關(guān)，并可在軟骨及胚胎發(fā)育過(guò)程中高度表達(dá)。本研究通過(guò)qRT-PCR與Western blot法檢測(cè)PRELP表達(dá)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組子宮內(nèi)膜組織中PRELP mRNA及蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，說(shuō)明子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中PRELP呈上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，PRELP與VEGF、TNF-α及CA125呈正相關(guān)，其中TNF-α在腦組織及胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并與腺體細(xì)胞的浸潤(rùn)能力緊密相關(guān)，可在發(fā)生病變時(shí)高度表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞的增殖及遷移。說(shuō)明PRELP可能參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程，推測(cè)PRELP可能通過(guò)影響TNF-α等的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)患者病情發(fā)展。

SMOC2主要存在于非基底膜中，并與心臟、腎等組織器官發(fā)育有關(guān)。研究[17]表明，SMOC2還在胸腺、卵巢中表達(dá)，并參與許多相關(guān)生理過(guò)程。近來(lái)研究[18]發(fā)現(xiàn)，SMOC2的生物學(xué)功能可通過(guò)刺激人類內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，增強(qiáng)亞基成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的血管生成?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)qRT-PCR與Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥患者及正常子宮內(nèi)膜組織中SMOC2表達(dá)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者子宮內(nèi)膜組織中SMOC2表達(dá)高于對(duì)照組，說(shuō)明SMOC2在子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中呈高度表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SMOC2與IL-1β及CA125呈正相關(guān)，說(shuō)明SMOC2可能通過(guò)與血清相關(guān)因子相互作用進(jìn)而參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展并加快病情惡化。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2對(duì)臨床診斷子宮內(nèi)膜異位癥具有較高的預(yù)判價(jià)值，說(shuō)明子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2可作為臨床診斷子宮內(nèi)膜異位癥的預(yù)測(cè)因子。同時(shí)，本研究對(duì)影響子宮內(nèi)膜異位的相關(guān)因素進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP及SMOC2均為子宮內(nèi)膜異位癥患者的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明三者均可相互作用并對(duì)疾病的發(fā)展起到促進(jìn)作用。本研究結(jié)果揭示，子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2高表達(dá)并可促進(jìn)新生血管的生成，進(jìn)而增加病變細(xì)胞的增殖速率，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥病情持續(xù)性發(fā)展，且三者均可作為臨床診斷子宮內(nèi)膜異位癥的分子標(biāo)記物。

綜上所述，子宮內(nèi)膜組織中ID2、PRELP、SMOC2高表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，三者均可能成為子宮內(nèi)膜異位癥的候選特異性靶基因，且均可作為臨床診斷子宮內(nèi)膜異位癥的標(biāo)志物。本研究存在不足之處，關(guān)于ID2、PRELP、SMOC2在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病及進(jìn)展中的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。