星點-響應面法優(yōu)選闊葉十大功勞葉中小檗堿的提取工藝*

蒲忠慧，代 敏，韓榮祥，王雄清

1. 成都醫(yī)學院 四川省動物源性食品獸藥殘留防控技術工程實驗室(成都 610500)；2. 綿陽師范學院 生命科學與技術學院(綿陽621006)

闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.) Carr系小檗科十大功勞屬，該屬植物根、莖、葉均可人藥。以根、莖入藥的稱為功勞木，以葉入藥的稱為功勞葉?，F(xiàn)代藥理研究[1-2]表明，二者均具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主治肺癆咯血、胃火牙痛、濕熱瀉痢、目赤腫痛、癰腫瘡瘍等病癥?；瘜W成分研究[3-5]表明，功勞木和功勞葉中含有生物堿、揮發(fā)油、黃酮類、酚酸類、木質素類等成分，其中生物堿是其發(fā)揮藥效的主要物質基礎，小檗堿是功勞屬植物生物堿的主要有效成分之一。近年來，國內外對功勞木生物堿提取工藝已有相關報道[6]，但對功勞葉的研究主要集中在質量標準及其含量測定方面[7-9]，對其主要成分小檗堿提取工藝的研究較少，以星點-響應面設計法優(yōu)選功勞葉中小檗堿的提取工藝目前尚無報道。因此，本研究以小檗堿的含量為指標，采用星點設計-響應面法優(yōu)選闊葉十大功勞葉中小檗堿提取工藝，以期為其生物堿類成分的開發(fā)利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

闊葉十大功勞葉(產(chǎn)地：四川，批次：150620)，購于成都荷花池中藥材市場，經(jīng)綿陽師范學院羅明華教授鑒定為小檗科植物闊葉十大功勞的干燥葉；鹽酸小檗堿標準品(批號：110713-201613)，購于中國食品藥品檢定研究院；所用其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

I9型雙光束紫外可見分光光度計(濟南海能儀器股份有限公司)；EL204-IC電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；拜杰BJ-100型高速多功能粉碎機(浙江愛雪廚房設備有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀RE-2000A(上海亞榮生化儀器廠)；KQ2200E型超聲清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制及標準曲線的繪制 精密稱取鹽酸小檗堿對照品5 mg，加甲醇-鹽酸(100∶1)溶解并定容至50 mL容量瓶中，搖勻，即得對照品溶液。分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL對照品溶液，置于5個25 mL容量瓶中，分別加甲醇-鹽酸(100∶1)溶解并定容至刻度，以不加鹽酸小檗堿同法制得空白對照，在345 nm波長下測定吸光度。以吸光度為縱坐標，鹽酸小檗堿濃度(μg/mL)為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 功勞葉中小檗堿的提取及測定 取闊葉十大功勞葉粉碎過2號篩，精密稱取5.0 g，置具塞錐形瓶中，按一定料液比加入一定濃度乙醇，超聲處理45 min，過濾，濃縮成浸膏。精密稱取一定量浸膏，加甲醇-鹽酸(100∶1)溶解并定容至50 mL容量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取1 mL供試品溶液，按照“1.3.1項下”方法操作。

1.3.3 精密度試驗 取同1份對照品溶液1.0 mL，按“1.3.1項下”方法操作，于345 nm處連續(xù)測定吸光度6次，計算吸光度的RSD。

1.3.4 重復性試驗 精密吸取功勞葉提取液1.0 mL，平行6份，按“1.3.1項下”方法操作，345 nm處測定吸光度，計算RSD。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取功勞葉提取液1.0 mL，按“1.3.1項下”方法操作后，放置0、0.5、1、2、3、4 h，測定吸光度，計算RSD。

1.3.6 星點試驗設計 在預試驗基礎上，選取料液比、乙醇濃度、超聲時間和提取次數(shù)為考察因素，其中提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，結合工業(yè)實際生產(chǎn)，暫定為2次。根據(jù)Design Expert 8.0.6.1星點設計原理，每因素設5個水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示，因素水平如下(表1)。

表1 星點設計試驗因素水平表

1.3.7 驗證試驗 精密稱取功勞葉粉末30.0 g，按照最佳提取工藝條件進行驗證試驗，平行3次，按“1.3.1項下”方法于345 nm處測定試驗樣品中小檗堿的含量。

2 結果

2.1 鹽酸小檗堿的標準曲線

以吸光度為縱坐標，鹽酸小檗堿濃度(μg/mL)為橫坐標繪制標準曲線。得回歸方程Y=0.068 65X-0.000 7，相關系數(shù)r= 0.999 7。結果表明，鹽酸小檗堿在濃度2.0～10.0 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.2 精密度試驗

取同1份對照品溶液1.0 mL，按“1.3.1項下”方法操作，于345 nm處連續(xù)測定6次，吸光度分別為0.409 1、0.403 8、0.404 6、0.408 7、0.402 2、0.400 0，RSD為0.89%。結果顯示，儀器精密度良好。

2.3 重復性試驗

取同1份對照品溶液1.0 mL，平行6份，按“1.3.1項下”方法操作，345 nm處測定6份的吸光度分別為0.687 9、0.673 0、0.694 3、0.668 1、0.687 6、0.670 0，RSD為1.63%。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取功勞葉提取液1.0 mL，按“1.3.1項下”方法操作后，放置0、0.5、1、2、3、4 h，結果表明，溶液4 h內穩(wěn)定，其吸光度的RSD值為0.78 %。

2.5 星點設計試驗結果

以小檗堿含量為評價指標，試驗安排及結果如下(表2)。利用Design Expert 8.0.6.1軟件對響應面實驗結果進行分析，得以綜合評分Y為目標函數(shù)的二次回歸方程：

Y=-6.888 52+0.149 59A+0.280 44B-0.058 135C-(1.944 44E-003)AB+(1.111 11E-003)AC+(1.250 00E-003)BC-(3.190 35E-003)A2-(2.747 59E-003)B2-(3.475 87E-004)C2

1)

為了檢驗該二次回歸方程1)所構建的模型是否差異有統(tǒng)計學意義，進一步進行了回歸方程方差分析，并對各響應因子及響應因子交互作用回歸系數(shù)進行了檢驗，結果如下(表3)。從表3中第1行可知二次回歸方程1)所建立的模型差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)，且失擬檢驗系數(shù)為0.195 7，說明模型失擬差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，實驗響應值綜合評分主要受所選取的料液比、乙醇濃度和超聲時間影響，其他外來因素對模型的影響較小，該模型能較準確地預測出最佳提取工藝參數(shù)；A、B、C 3個因素的一次項回歸系數(shù)中A和B均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明料液比和乙醇濃度對樣品提取中鹽酸小檗堿的含量影響大；AB、AC、BC 3個交互項回歸系數(shù)中AB、BC差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明料液比和乙醇濃度、乙醇濃度和超聲時間的交互項對樣品提取中小檗堿的含量有影響；其中由A、B、C 3項的P值可以看出，3個因素中，對綜合評分的影響大小為：B>A>C。

表2 星點試驗設計及結果

表3 回歸方程方差分析

2.6 工藝條件優(yōu)化與預測

根據(jù)回歸方程，作響應曲面圖(圖1)，根據(jù)所擬合的響應曲面形狀，分析料液比、乙醇濃度和超聲時間對功勞葉中小檗堿含量的影響?；谝呀⒌臄?shù)學模型，得到最佳提取條件為：料液比12.94∶1，乙醇濃度54.38%和超聲時間34.83 min，小檗堿含量0.691%?？紤]到實際操作條件，故把功勞葉中小檗堿最佳提取工藝修正為：13倍量54%乙醇超聲提取2次， 35 min/次。

2.7 驗證試驗結果

精密稱取功勞葉粉末30.0 g，按照最佳提取工藝條件進行驗證試驗，平行3次，結果表明，功勞葉中小檗堿平均含量為0.683%(RSD=0.85%，n=3)，預測值為0.691%，偏差率1.16%，說明該回歸模型建立合理，具有良好的預測性。

圖1 料液比、乙醇濃度和超聲時間對功勞葉中小檗堿含量影響的響應面圖注：A：料液比；B：乙醇濃度；C：超聲時間；R1：響應值

3 討論

現(xiàn)代藥理研究[10-13]表明，功勞葉具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性，其中生物堿類成分是主要藥效物質基礎。功勞葉中生物堿類型主要為異喹啉類，包括小檗堿、巴馬汀和藥根堿等，小檗堿為主要有效成分之一。因此，本研究選擇小檗堿指標成分的含量變化作為功勞葉生物堿含量考察的指標，以期為進一步完善功勞葉藥材的質量標準奠定基礎。

響應曲面法是采用多元二次回歸法，通過對擬合后的回歸方程進行分析，尋找最優(yōu)工藝參數(shù)，同時還可以更好地處理離散水平值，與正交設計和均勻設計法相比，可更直觀、精確地得到最優(yōu)組合條件[14]。該工藝已被廣泛應用于中藥提取工藝的優(yōu)化過程[15-16]。本實驗通過星點-響應曲面法考察了液料比、乙醇濃度和超聲時間對功勞葉小檗堿含量的影響。二次方程的模型回歸差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)，且二次方差分析后的失擬項檢驗差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明本試驗設計科學合理。利用回歸模型對影響小檗堿含量的關鍵因素及其相互作用進行探討，結果表明，因素A和B(料液比與乙醇濃度)影響最大(P<0.001)，因素C(超聲時間)影響較大(P<0.01)；3個交互項AB、BC對小檗堿提取影響次之(P<0.05)，AC無影響(P>0.05)。通過工藝條件的優(yōu)化得到功勞葉中小檗堿最佳提取工藝條件：13倍量54%乙醇超聲提取2次，35 min/次。在此條件下進行驗證試驗，實測小檗堿平均含量為0.683%，RSD為0.85%，與擬合方程預測值0.691%比較，平均偏差為1.16%，與預測值很接近。由此說明，利用星點-響應面法優(yōu)選闊葉十大功勞葉中小檗堿的提取工藝合理可靠。該研究結果為闊葉十大功勞葉藥材及其制劑的開發(fā)提供了一定的參考和依據(jù)。在現(xiàn)有分離提取生物堿的方法上，可進一步探索能分離提取獲得高純度的非生物堿方法，以期更加充分合理利用闊葉十大功勞葉資源。