西南地區(qū)HPV-6和HPV-11 E6/E7 基因多態(tài)性分析*

萬秋伶，丁顯平△，高 鵬，方蒞媛

1.四川大學 生命科學學院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川大學 生命科學學院遺傳醫(yī)學研究所(成都 610065)；2.特色生物資源資源研究與利用川渝共建重點實驗室(四川 610064，重慶 408400)；3.重慶特色生物產業(yè)技術創(chuàng)新研究院(重慶 408400)

人乳頭瘤病毒6型(HPV-6)和11型(HPV-11)，通常被認為是“低危型”HPV，可引起黏膜感染，導致潛在致命疾病感染，如惡性喉癌或惡性喉乳頭狀瘤[1-2]。 HPV-6和HPV-11誘導的黏膜感染可引起尖銳濕疣，往往會引起負面影響，對醫(yī)療保健系統(tǒng)和患者是一個重大負擔，給患者帶來嚴重的心理困擾[3-4]。在結構上，HPV是雙鏈環(huán)狀DNA病毒，編碼“早期”(E包括E1、E2、E4、E5、E6和E7)和“晚期”(L包含L1和L2)蛋白[5-6]。在HPV編碼的蛋白質中，E6和E7已被證明是重要的致病性HPV蛋白，嚴格調節(jié)HPV誘導的腫瘤發(fā)生[7-8]。然而，“低危型”HPV E6和E7蛋白可能導致惡性進展的分子機制尚不完全清楚[9]。因此，本研究結果可能對理解內在的地理相關性和生物學差異具有重要意義，為HPV-6和HPV-11的預防、診斷及治療，甚至基于HPV蛋白E6和E7的治療性疫苗的設計研究提供重要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

選取2015～2017年在四川省生殖健康研究中心?？漆t(yī)院、成都安琪兒婦產醫(yī)院、成都陽光醫(yī)院及西南地區(qū)部分醫(yī)院接受HPV篩查的患者，收集228例HPV-6/HPV-11陽性標本(男性取一定大小的疣體組織，置于生理鹽水中，女性取宮頸分泌物置于宮頸保存液中)。醫(yī)師聯(lián)合采集，標本采集時已征得患者知情同意。樣品置于-20 ℃下保存直至DNA提取。

1.2 試劑與儀器

DNA基因測序分析儀(Applied Biosystems,3500,DNA Genetic Analyzer)，PCR擴增儀(北京東勝科學儀器有限公司)，微量移液器(上海大龍醫(yī)療設備有限公司)，生物安全柜(安徽航天生物科技有限公司) ， GSG-2000核酸/蛋白凝膠圖像分析系統(tǒng)(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司) ，HPV基因分型提取檢測試劑盒(亞能生物技術有限公司)，10×PCR緩沖液(Mg2+)，2.5 mM dNTPs，2U Taq DNA聚合酶。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計 引物設計參考序列為 Genbank No：X00203和No: M14119(表1)。

表1 HPV E6/E7 PCR引物設計

1.3.2 DNA提取 根據(jù)制造商說明，使用低風險HPV基因分型實時PCR試劑盒(亞能生物，中國)進行DNA提取。首先，移取1 mL分泌物，置于1.5 mL離心管中。其次，將細胞懸浮液在微量離心機中以13 000 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min，保留沉淀物，加入100 μL煮沸10 min的核酸提取物。 最后，上清液準備通過實時PCR擴增。

1.3.3 PCR擴增 片段的擴增在25 μL反應體積中進行，其中含有10×PCR緩沖液(Mg2+)，2.5 mM dNTPs，2U Taq DNA聚合酶，90 pmol引物。 PCR擴增由以下條件組成：95 ℃初始5 min變性，39個擴增循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性45 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 s；最后72 ℃保存5 min。所有擴增的HPV-6/HPV-11 E6和E7 DNA產物均在含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳中檢測，并送至上海生工有限公司進行測序。

1.4 E6和E7基因序列分析

所有數(shù)據(jù)均通過重復PCR擴增和序列分析至少兩次來確認。隨后用NCBI BLAST，DNAMAN版本5.2.2和Primer Premier 5 分析序列和變體。HPV-6 DNA核苷酸突變根據(jù)HPV-6參考Genbank序列(No：X00203)進行對比，HPV-11 DNA核苷酸突變根據(jù)HPV-11參考Genbank序列(No：M14119)進行對比。MEGA軟件(http://www.megasoftware.net/home)被用來構建系統(tǒng)發(fā)育樹，針對HPV E6和E7不同的突變株。收集已發(fā)表的國內外不同地區(qū)的HPV序列作為制作進化樹的參考序列。

1.5 選擇壓力分析

通過使用PAML 4.8軟件(codeml工具)進行似然比檢驗(likelihood ratio tests，LRT)，以推斷非同義/同義核苷酸分歧。使用樸素經驗貝葉斯(NEB)方法，用后驗概率P≥0.99識別正向選擇的位點，預測可能受到正向選擇的HPV-6/11 E6和E7 基因序列中的位點[10-11]。

2 結果

2.1 PCR擴增

PCR擴增的產物均在含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析，檢驗擴增的效果，觀察電泳所跑出的目的條帶，均有清晰條帶出現(xiàn)，篩選出的HPV陽性樣本有相應的目的條帶出現(xiàn)(圖1)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

注：A:HPV-6 E6/E7;B:HPV-11 E6/E7；DNA Marker I/DNA Marker II

2.2 HPV-6 E6 序列分析

將123個HPV-6 E6基因序列與GenBank HPV-6參考序列(X00203)進行比較，鑒定出7個多態(tài)性位點(G40T，A120T，C150G，A222T，A264T，C291T，G372A)。其中突變G40T(D14Y)，C150G(H50Q)會導致氨基酸發(fā)生突變，非同義突變D14Y發(fā)生在編碼HPV-6 α螺旋的區(qū)域內。5個屬同義突變(A120T，A222T，A264T，C291T，G372A)。值得注意的是，120位的A-T突變率和372位的G-A突變率是100%。

HPV6 E6序列的貝葉斯系統(tǒng)進化樹，出現(xiàn)4個分支(圖2)。從突變株數(shù)據(jù)也可以發(fā)現(xiàn)，只有3種類型的突變株被鑒定出來，黑正方形的變異株是參考突變株，說明E6基因具有高度的保守性。其中突變株HPV6 E601也是數(shù)量最多的突變株，與參考序列最接近，同源性達到了94%，說明這個分離株很有可能來源于參考序列(X00203)。

圖2 HPV6基因E6的貝葉斯系統(tǒng)進化樹

2.3 HPV-6 E7 序列分析

與參考序列(X00203)相比，所研究的123個E7 HPV-6序列中的核苷酸變異率為34.15%，共鑒定出5個單核苷酸變化(A10G，G11A，G100A，T155A，C294A)，其中A10G(R4E)、G11A(R4E)、G100A(E34Q)、T155A(F52Y)是非同義的，C294A是同義突變。 最常見的非同義序列突變T155A，此位點在編碼鏈中發(fā)生F52Y(苯丙氨酸至絡氨酸)氨基酸的變化。 在分析的E7 HPV-6變體中未鑒定出插入、缺失或過早終止密碼子。

HPV6 E7序列的貝葉斯系統(tǒng)進化樹，共5個分支，被鑒定出來的3個類型分離株在3個分支上面，分離株HPV6E701沒有找到對應的亞型，或許是1個新的分支；由于該類型分離株的數(shù)量較少，所以朝這個方向進化E7也應該很少(圖3)。

圖3 HPV6基因E7的貝葉斯系統(tǒng)進化樹

2.4 HPV-11 E6 序列分析

與HPV-11參照序列(M14119)相比，在108個HPV-11 E6基因序列中顯示序列多態(tài)性發(fā)生在4個核苷酸位置(T63C、T22C、C279T、G365A)。 且只存在1個非同義突變G365A(G122E)，僅占一小部分(7.5%)。第63個堿基中T至C的突變頻率為100%。 此外，非同義突變編碼α螺旋，通過比對來自所有病毒株的E6 核苷酸序列,分析HPV-11 E6序列,不存在插入和缺失事件。HPV11 E6序列的貝葉斯系統(tǒng)進化樹，共3個分支，被鑒定出來的3個類型分離株在3個分支上面，均找到相對應的亞型(圖4)。

圖4 HPV11基因E6的貝葉斯系統(tǒng)進化樹

2.5 HPV-11 E7序列分析

與HPV-11參考序列(M14119)相比，E7的核苷酸變異率為88.8%。在297 bp E7 開放閱讀框中僅鑒定出1個單核苷酸變化(G133T)，是非同義的(A45S)。 E7的序列變異性低于E6。 G133T占較大比例(88.8%)，導致氨基酸A45S(從丙氨酸到絲氨酸)的變化。 但蛋白質二級結構沒有改變，仍然是α螺旋。在所研究的HPV-11 E7變體中沒有核苷酸缺失或過早終止密碼子的證據(jù)，也不存在插入和缺失，HPV11 E7序列的貝葉斯系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，HPV11 E7基因呈現(xiàn)高度保守性(圖5)。

2.6 選擇壓力分析

鑒定HPV-6/11的E6和E7 基因序列進行選擇壓力分析，結果總結如下(表2)。在HPV-6 E6及HPV-11 E6、E7序列中未鑒定出正向選擇的位點；然而，在HPV-6 E7變體中鑒定出正向選擇位點R4E、E34K和F52Y。

圖5 HPV11基因E7的貝葉斯系統(tǒng)進化樹

模型對數(shù)似然差異 參數(shù)估計2△l正向選擇位點6-E6 M7-662.94P=12.390 37 q= 99.000 00不允許6-E6 M8-662.94p0=0.999 99 P=12.389 52 q= 99.000 000無p1= 0.000 01 w=1.000 00P=16-E7 M7-436.09P= 1.367 32 q= 0.005 00不允許6-E7 M8-433.89p0=0.939 31 P= 0.005 00 q= 8.823 474.404R??, 34E??, 52F??p1=0.060 69 w=29.562 83P<0.0111-E6 M7-643.67P=23.150 88 q= 99.000 00不允許11-E6 M8-643.670無11-E7 M7-410.18P=2.494 53 q= 0.005 00不允許11-E7 M8-410.000無

注：2Δl表示兩個模型之間對數(shù)似然差的兩倍

3 討論

本研究對來自中國西南地區(qū)231例HPV-6/11分離株的E6和E7 開放性閱讀框架進行了測序，以評估該群體中的HPV-6/11遺傳多樣性。鑒定了7種HPV-6 E6序列變體，其中的H50Q在30.08%的HPV-6序列中被鑒定出來，原型HPV-6 E6癌蛋白50位的氨基酸可能位于兩個內部鋅離子結合基序之間的中心，這對于E6蛋白穩(wěn)定性非常重要[12-13]。這些變種以前沒有在中國西南地區(qū)發(fā)現(xiàn)過，它們的功能影響需要進一步分析?？傮w而言，HPV-6 E6序列在分析的患者隊列中顯示高度保守，同樣，鑒定了5種HPV-6 E7變體，其中4種表現(xiàn)出相應的E7氨基酸變化。最常見的E7 HPV-6突變是T155A和C294A。值得注意的是，T155A突變影響了34.15%(42/123)患者，并導致F52Y(苯丙氨酸至酪氨酸)氨基酸轉化，預計會影響蛋白質的二級結構。盡管如此，對于HPV-6 E6、E7序列在患者隊列中顯示高度保守，它們在HPV-6結構和功能中發(fā)揮重要作用，與國外專家先前研究[14-15]一致。因此，它們可能也是HPV-6引物設計和診斷檢測的有希望的靶標。在HPV-11 E6中觀察到的常見突變是T63C，在HPV-11 E7中是G133T， 而HPV-11 E6中最常見的非同義突變是G365A。 當選擇E6 / E7作為引物設計或診斷檢測的靶標時，這些突變可能被認為是重要的[16]。本研究分析以評估HPV-6/11 E6和E7序列是否受到正向選擇，正向選擇的主要特征是它導致等位基因頻率異?？焖偕仙?，從而使物種能夠迅速適應環(huán)境變化[17]。在HPV-6 E6和HPV-11 E6 / E7序列中未鑒定出正向選擇位點，鑒于其在患者群組中的高水平保守性，這是不足為奇的。相反，檢測到HPV-6 E7序列在變體位點4R**、34E**和52F**處受到正向選擇，這表明這些位點可能具有進化意義，并賦予生存優(yōu)勢。所有臨床樣本均來自中國西南地區(qū)，具有強大的區(qū)域代表性。發(fā)現(xiàn)了幾個新的突變，這將為與中國西南地區(qū)人群有關的治療性疫苗的開發(fā)提供真實有效的證據(jù)。因此，本研究結果擴展了目前中國西南地區(qū)HPV-6/11遺傳多樣性的知識，也為HPV-6/11流行病學、進化、功能、發(fā)病機制和使用的未來研究提供了寶貴資源。