清營湯聯(lián)合恩諾沙星干預(yù)S.Typhimurium復(fù)發(fā)性感染的C57BL/6小鼠模型研究*

唐宋琪，孫 濤，陳云慧，冷 平△

1.海南醫(yī)學(xué)院(?？?571199)； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都 611137)

沙門氏菌(salmonella)感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問題，不僅影響發(fā)展中國家的經(jīng)濟(jì)建設(shè)，發(fā)達(dá)國家也飽受困擾[1-2]。盡管沙門氏菌對抗生素的治療反應(yīng)迅速，但由于療程及細(xì)菌特殊狀態(tài)等因素導(dǎo)致殺菌不徹底，體內(nèi)存留的沙門氏菌往往成為復(fù)發(fā)性感染或反復(fù)發(fā)作性感染的根源[3]。中藥治療感染性疾病的歷史悠久、療效確切，中藥聯(lián)合抗生素的治療方案優(yōu)勢特色明顯，主要表現(xiàn)為增效減毒作用[4]。已往研究[5]發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方清營湯具有養(yǎng)陰透熱，清營解毒之功效，臨床廣泛用于治療感染性疾病和炎性疾病。本研究通過建立鼠傷寒沙門氏菌(salmonella.Typhimurium，S.Tm)感染C57BL/6小鼠模型，評價(jià)中藥復(fù)方清營湯聯(lián)合抗生素恩諾沙星干預(yù)S.Tm感染復(fù)發(fā)的作用效應(yīng)，為中藥聯(lián)合抗生素防治沙門氏菌復(fù)發(fā)性感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠，SPF級，6～8周齡，雌雄各108只，體重(18±2)g。購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司SCXK(川)2014-028，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室SYXK(瓊)2012-0013。經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 菌株S.Tm菌株由英國帝國理工學(xué)院Boyle教授惠贈。

1.1.3 藥品 5%恩諾沙星注射液(Bayer，德國)；清營湯(《溫病條辨》)：犀角(水牛角代)30 g、生地黃15 g、元參9 g、竹葉心3 g、麥冬9 g、丹參6 g、黃連5 g、銀花9 g、連翹6 g，購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司。

1.1.4 主要試劑 LB瓊脂粉(Cat.22700025，Invitrogen，美國)；LB液體培養(yǎng)基(Cat.10855021，Gibco，美國)；PBS緩沖液(Cat.70011044，Gibco，美國)；MEM Hank's培養(yǎng)液(Cat.11575032，Gibco，美國)；FBS胎牛血清(Cat.10099141，Gibco，美國)；NaHCO3(天津致遠(yuǎn))。

1.1.5 主要儀器 Heratherm微生物培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國)；全自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Champ Chemi 610，北京賽智)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 清營湯藥液制備 先將水牛角置煎器內(nèi)加水1 000 mL煎煮1 h，然后加入生地黃、元參、麥冬、丹參、黃連5味藥煎煮30 min，最后加入銀花、連翹、竹心3味藥煎煮10 min，濾取藥液。藥渣加水600 mL，再煎20 min，濾取藥液。將兩次煎出液合并，濃縮為1 g生藥/mL，備用。

1.2.2 恩諾沙星藥液制備 使用滅菌蒸餾水將5%恩諾沙星注射液(100 mL∶5 g)稀釋為2 mg/mL，備用。

1.2.3 染毒菌液制備S.Tm菌劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，靜置培養(yǎng)過夜。4 ℃，5 000 g/min，離心10 min，收集細(xì)菌，采用PBS緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度為2×1010CFU/ mL，備用。

1.2.4 小鼠S.Tm腸道感染模型建立 每只小鼠灌胃3% NaHCO3溶液200 μL，隨后灌胃給予S.Tm菌液200 μL(含菌量4×109CFU)。染毒2 d后，開始分組干預(yù)。

1.2.5 動物分組 小鼠造模2 d后，隨機(jī)分為：模型組(Model)、恩諾沙星組(Enrofloxacin，ENR)、清營湯+恩諾沙星組(QENR)；小鼠生存率及糞便脫落細(xì)菌檢測，每組設(shè)置小鼠10只；小鼠MLN組織載菌量檢測，設(shè)置14個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組，每個(gè)亞組小鼠6只；為避免糞便造成交叉感染，所有小鼠均單籠飼養(yǎng)。

1.2.6 干預(yù)方法 模型組小鼠正常飲食飲水，每日按0.4 mL/10 g體重灌胃注射用滅菌水；恩諾沙星組小鼠在飲水中加入恩諾沙星濃度為2 mg/mL，每日按0.4 mL/10 g體重灌胃注射用滅菌水；清營湯+恩諾沙星組小鼠在飲水中加入恩諾沙星濃度為2 mg/mL，同時(shí)每日按臨床等效劑量15 g生藥/kg體重灌胃清營湯藥液。連續(xù)干預(yù)7 d。

1.2.7 指標(biāo)檢測 小鼠一般狀態(tài)觀察 每天觀察小鼠體征并記錄，當(dāng)小鼠瀕臨死亡時(shí)(用手指輕輕戳動小鼠，未顯示任何運(yùn)動)，脫頸處死。小鼠腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric Lymph Nodes, MLNs)細(xì)菌定植檢測 每隔2 d從各干預(yù)組的時(shí)間點(diǎn)亞組中隨機(jī)抽取1組小鼠處死，解剖取出小鼠MLN，置2% FBS-MEM Hank's液中勻漿，連續(xù)稀釋后，接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，采用凝膠成像系統(tǒng)對菌落進(jìn)行全自動計(jì)數(shù)。小鼠糞便脫落細(xì)菌檢測 收集小鼠糞便顆粒稱重，PBS液中均質(zhì)后，連續(xù)稀釋，接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，采用凝膠成像系統(tǒng)對菌落進(jìn)行全自動計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 清營湯聯(lián)合恩諾沙星對S.Tm腸道感染小鼠生存率的影響

小鼠經(jīng)口感染S.Tm后，模型組小鼠在第3天(對應(yīng)其它組抗生素治療第1天)出現(xiàn)異常表現(xiàn)：自發(fā)活動明顯減少、困倦，被毛豎立等；從感染第4天開始，模型組小鼠陸續(xù)死亡，至感染后第8天全部死亡(對應(yīng)其它組抗生素治療第6天)。恩諾沙星組及清營湯+恩諾沙星組小鼠在藥物干預(yù)期間未發(fā)生死亡。停藥后第3天，恩諾沙星組部分小鼠開始出現(xiàn)自發(fā)活動減少。從停藥后第7天開始，恩諾沙星組小鼠出現(xiàn)死亡，至停藥后14 d全部死亡(即抗生素治療后第21天)。清營湯+恩諾沙星組小鼠在停藥后出現(xiàn)異常表現(xiàn)及發(fā)生死亡比恩諾沙星組晚(停藥后第6天開始出現(xiàn)異常體征；停藥后第8天第一只小鼠死亡)，4只小鼠至實(shí)驗(yàn)結(jié)束未發(fā)生死亡，且一般狀態(tài)良好，生存率為40%(圖1)。

圖1 S.Tm感染小鼠生存率

2.2 清營湯聯(lián)合恩諾沙星對S.Tm腸道感染小鼠MLN載菌量的影響

小鼠接受恩諾沙星治療后，對抗生素的反應(yīng)非常迅速，表現(xiàn)為MLN組織載菌量較模型組明顯減少，4 d后基本殺滅了MLN中的細(xì)菌，平板法檢測不到細(xì)菌(圖2)。然而，停藥1 d后，恩諾沙星組小鼠MLN組織中再次檢測到細(xì)菌，載菌量隨時(shí)間呈指數(shù)增加，且與小鼠的感染體征和死亡具有同步性(圖1)，提示原發(fā)感染出現(xiàn)復(fù)發(fā)。清營湯+恩諾沙星組小鼠MLN組織中細(xì)菌清除速度較恩諾沙星組稍快，停藥后，部分小鼠MLN組織中再次檢測到細(xì)菌，在同一時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌的檢出比例較恩諾沙星組低，然而細(xì)菌一旦檢出，其隨時(shí)間變化的載菌量與恩諾沙星組并無差異(圖3)。

圖2 S.Tm感染小鼠MLN細(xì)菌含量

注：模型組小鼠在感染后第8天全部死亡，此后檢測數(shù)據(jù)缺失；恩諾沙星組小鼠在治療后第21天全部死亡，此后檢測數(shù)據(jù)缺失；N.D.表示未檢測到細(xì)菌

圖3 S.Tm感染小鼠MLN組織細(xì)菌檢出率

2.3 清營湯聯(lián)合恩諾沙星對S.Tm腸道感染小鼠糞便脫落細(xì)菌的影響

小鼠接受恩諾沙星治療后，4 d左右細(xì)菌不再從小鼠糞便中排出。在停用抗生素治療后，恩諾沙星組小鼠從第3天開始恢復(fù)細(xì)菌排泄，在檢測到新的糞便排菌后不久，排菌小鼠出現(xiàn)明顯的感染體征，最終死于復(fù)發(fā)性感染。清營湯+恩諾沙星組小鼠出現(xiàn)糞便排菌的時(shí)間與恩諾沙星組無差異，但糞便細(xì)菌檢出率明顯低于恩諾沙星組。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，清營湯+恩諾沙星組存活小鼠糞便中始終未檢出細(xì)菌(圖4)。

圖4 S.Tm腸道感染小鼠糞便脫落細(xì)菌檢出率

3 討論

沙門氏菌感染的復(fù)發(fā)通常發(fā)生在抗生素治療后，是人類傷寒的一個(gè)常見而明顯的臨床現(xiàn)象。長療程的抗生素治療方案依從性欠佳，并且造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，尤其是在發(fā)展中國家[6]。因此，人們更希望尋找短療程的治療方案，但困擾短療程抗生素治療方案的瓶頸是感染復(fù)發(fā)問題。國外研究[7]發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌的復(fù)發(fā)感染主要是由于該細(xì)菌可形成“非復(fù)制型持續(xù)細(xì)胞”狀態(tài)而存留于人體內(nèi)。沙門氏菌在抗生素壓力下，部分細(xì)菌的復(fù)制速度減慢，甚至停止復(fù)制，這一狀態(tài)的特點(diǎn)是細(xì)菌對抗生素不再敏感，產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。當(dāng)抗生素撤去之后，細(xì)菌再次恢復(fù)復(fù)制能力，并可重新感染其它宿主細(xì)胞。沙門氏菌潛伏體內(nèi)，伏而再發(fā)的現(xiàn)象與中醫(yī)溫病學(xué)伏氣致病的病機(jī)具有宏觀相似之處。中醫(yī)針對伏氣致病常采用透邪外達(dá)、透營轉(zhuǎn)氣等治法，其經(jīng)典代表方為清營湯，臨床將該方作為主方大量應(yīng)用于溫?zé)嵝愿腥炯膊〉闹委煛?/p>

據(jù)此，我們推測中醫(yī)透邪外達(dá)治法及其代表方清營湯可能通過影響沙門氏菌“非復(fù)制型持續(xù)細(xì)胞”狀態(tài)的形成，提高其對抗生素的敏感性，增強(qiáng)抗生素的殺菌作用，縮短療程，預(yù)防復(fù)發(fā)。為了證實(shí)這一假說，我們設(shè)計(jì)了本文研究。在本文研究中，重點(diǎn)關(guān)注了干預(yù)措施對MLN載菌量的影響，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MLN是沙門氏菌形成“非復(fù)制型持續(xù)細(xì)胞”的主要場所，且與糞便排菌密切相關(guān)[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)抗生素治療的小鼠，在感染后8 d內(nèi)全部死亡。接受抗生素治療的小鼠全部存活，7 d的抗生素療程足以殺滅小鼠MLN組織內(nèi)的沙門氏菌，同時(shí)糞便中脫落的細(xì)菌也未能檢出。當(dāng)抗生素撤去1 d之后，即有小鼠MLN組織中再次檢測到細(xì)菌，3～7 d后糞便中也再次檢測到細(xì)菌，并出現(xiàn)感染復(fù)發(fā)的體征，最終死亡。然而，清營湯聯(lián)合抗生素治療后的小鼠不論是在MLN組織中還是在糞便中檢測到細(xì)菌的時(shí)間均較單純接受抗生素治療的小鼠晚，并且最終約有40%的小鼠存活。

綜上所述，清營湯聯(lián)合恩諾沙星治療沙門氏菌感染可有效減少復(fù)發(fā)性感染的發(fā)生率，發(fā)揮對抗生素的增效作用。