Bromodomains識(shí)別并結(jié)合配體的機(jī)理研究

吳 超,陳競(jìng)哲

(1.上海大學(xué) 物理系 上海 200444;2.上海大學(xué) 量子與分子結(jié)構(gòu)中心，上海 200444)

在生物的表觀遺傳學(xué)中，Bromodomains(BRDs)識(shí)別組蛋白上配體(乙酰化賴氨酸)并與之結(jié)合的機(jī)制是基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的重要一環(huán)，而與該機(jī)制相應(yīng)的藥物研究在癌癥、白血病和HIV等重大免疫性疾病治療領(lǐng)域具有巨大價(jià)值[1-2]。近年來，在眾多BRDs識(shí)別配體機(jī)制的研究中，廣大研究者為了尋找新的BRDs結(jié)構(gòu)或開發(fā)BRDs小分子抑制劑，大多以BRDs的自身結(jié)構(gòu)作為出發(fā)點(diǎn)，雖然新的BRDs結(jié)構(gòu)和小分子抑制劑層出不窮，但是其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或藥物分子與目標(biāo)氨基酸分子結(jié)合之后的穩(wěn)定性卻少有觀察和研究[3]。本研究將以BRDs與配體的結(jié)合體為研究對(duì)象，首先對(duì)BRDs結(jié)合位點(diǎn)的自身幾何結(jié)構(gòu)采用2015年新開發(fā)的結(jié)合位點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)方法進(jìn)行分析，進(jìn)而通過分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)結(jié)合體進(jìn)行研究，兩種方法的結(jié)果互相印證結(jié)合體的穩(wěn)定性，最終結(jié)果將有助于BRDs小分子藥物穩(wěn)定性提高的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

在釀酒酵母體內(nèi)的酵母重組蛋白-4亞基(Rsc4)中存在著一種Bromodomain，是為數(shù)不多的Bromo家族的一員，在蛋白質(zhì)晶體庫中其蛋白晶體結(jié)構(gòu)名稱為2r0v，它是Bromodomain與賴氨酸的穩(wěn)定結(jié)合體。為了提高研究效率，我們直接將結(jié)合體中結(jié)合位點(diǎn)所在的蛋白鏈A作為主要的研究對(duì)象,蛋白鏈A的氨基酸總數(shù)為293，有四個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)和兩個(gè)疏水性絆環(huán)，這些結(jié)構(gòu)形成了一個(gè)疏水性的口袋。為了探究Bromodomains識(shí)別并結(jié)合配體(ACK:乙?；嚢彼?的機(jī)理，通過FCTM和分子動(dòng)力學(xué)方法分別對(duì)蛋白鏈A進(jìn)行研究。

1.2 結(jié)合位點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)方法(FCTM)

FCTM(Fragment-centric topographical mapping)是Yingkai Zhang新開發(fā)的結(jié)合位點(diǎn)中心拓?fù)鋵W(xué)映射方法,是基于結(jié)合位點(diǎn)的局域幾何特征的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)分析方法[4]，其通過緊鄰原子中心坐標(biāo)得到與這些中心點(diǎn)相切的alpha球，其中過大的alpha球意味著這些緊鄰原子分布過于平坦，它們不能提供很好的凹性，過小的alpha球能提供足夠的空隙以結(jié)合配體。因此該方法先濾除過大或過小的alpha球，并通過對(duì)alpha球聚類，得到alpha球形成的數(shù)個(gè)團(tuán)簇，這樣的團(tuán)簇意味著它們鑲嵌在真實(shí)原子所形成的子結(jié)合位點(diǎn)(Subpocket)之中，因此能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)表面進(jìn)行劃分得到蛋白質(zhì)表面的子結(jié)合位點(diǎn)，并用不同顏色給蛋白質(zhì)表面染色以區(qū)分這些子結(jié)合位點(diǎn)。為定量描述這些子結(jié)合位點(diǎn)的性質(zhì)，F(xiàn)CTM 設(shè)計(jì)了幾個(gè)定量的特性參數(shù)，包括凹性得分(Score)、配體在該子結(jié)合位點(diǎn)上的占有率(Occupied)和非極性程度(Non-ploar)等，其中凹性得分越高說明結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別能力越強(qiáng)，反之則弱；占有率越高說明配體處在pocket的位置越深，結(jié)合也就越緊密，反之則疏松。

通過FCTM方法對(duì)初始2r0v模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可看到在結(jié)合位點(diǎn)的凹性方面score=60，同時(shí)其alphaspace=131，這兩項(xiàng)結(jié)果表明2r0v結(jié)合位點(diǎn)的幾何性質(zhì)有非常高的可識(shí)別性[5]，結(jié)果如表1所示。

表1 經(jīng)FCTM分析結(jié)果Table 1 Results of FCTM analysis

1.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)方法(MD：Molecular-dynamics simulation)是研究大分子體系時(shí)被廣泛采取的方法。MD方法主要應(yīng)用量子力學(xué)、牛頓力學(xué)以及統(tǒng)計(jì)力學(xué)等物理理論，其理論具有物理理論依據(jù)全面和精確度高的優(yōu)勢(shì)[6]。

1.3.1 模擬模型的建立

分子動(dòng)力學(xué)模擬最關(guān)鍵的工作是模型的建立，為了提高分子模擬的效率，我們直接將分子模擬的建模工作集中在結(jié)合位點(diǎn)的修飾上，具體步驟為：1.將晶體模型中的賴氨酸殘基人工改為乙?；嚢彼?；2.補(bǔ)足數(shù)據(jù)庫中由于實(shí)驗(yàn)誤差和解譜精確度導(dǎo)致缺失的原子，改正數(shù)據(jù)庫中指認(rèn)錯(cuò)誤的原子；3.構(gòu)建電中性且溶解于水的蛋白質(zhì)模型；4.應(yīng)用適當(dāng)?shù)牧?chǎng)。我們采用最流行的AMBER14SB力場(chǎng)對(duì)BRD建模[7]，對(duì)于水，則采用TIP3P模型。整個(gè)分子動(dòng)力學(xué)模擬分3個(gè)步驟：

(1)在NVT系綜將模型優(yōu)化，通過可視化軟件VMD觀察到整個(gè)“水盒子”里的水分子和蛋白質(zhì)都均勻地舒展開來，優(yōu)化過程需10 ps；

(2)約束蛋白質(zhì)，讓水溶液升溫，升至合理的體系溫度300 K，整個(gè)過程持續(xù)的時(shí)間為100 ps；

(3)模擬蛋白質(zhì)在生物環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)，通過逐步減小約束力常數(shù)來弛豫蛋白質(zhì)，而此時(shí)整個(gè)模擬的環(huán)境是NPT系綜，具體的模擬過程總結(jié)如表2所示。

表2 整個(gè)分子動(dòng)力模擬過程的參數(shù)設(shè)置Table 2 Parameter setting of the overall molecular dynamics simulation

2 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果

MD模擬之后，模擬過程中蛋白鏈的B-factor(溫度系數(shù))[6]和RMSD(蛋白鏈柔軟度)[8]如圖1和圖2所示。

從B-factor和RMSD圖清晰看到整條蛋白鏈A保持在一個(gè)穩(wěn)定的柔性狀態(tài)，圖1中B-factor值在實(shí)驗(yàn)與模擬之間存在著較大數(shù)值上的差距，主要是因?yàn)樵诩s束立場(chǎng)參數(shù)設(shè)置下模擬比實(shí)驗(yàn)更具穩(wěn)定性，所以模擬的整體結(jié)果數(shù)值更小[6]，而在殘基序列170-190的位置分子模擬因?yàn)榈鞍祖湹娜犴g性存在一個(gè)巨大的峰值，但該值和蛋白晶體數(shù)據(jù)庫中的B-factor值(實(shí)驗(yàn)值)是一致的，且實(shí)驗(yàn)值與模擬值之間的漲落趨勢(shì)是大致相同的，這足以說明模擬過程中蛋白鏈的穩(wěn)定性是準(zhǔn)確的。結(jié)合圖2中RMSD的變化就能充分說明蛋白鏈保持著相應(yīng)的柔韌度，而在整條鏈的前段、尾端、突出處和少量的折疊部分存在著較大的構(gòu)象變化，具體位置在殘基序列10-40,60-100,170-190,280-290，蛋白鏈A的平均構(gòu)象變化小于1.7 ?。上述結(jié)果表明該蛋白結(jié)構(gòu)域與配體的結(jié)合體是穩(wěn)定的。除了上述結(jié)果也可通過常規(guī)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)來分析其結(jié)合的狀態(tài)，具體如圖3所示：

圖1 A蛋白鏈B-factor值Fig.1 B-factor value of the A protein chain

在生物化學(xué)作用中氫鍵占據(jù)重要的地位，在模擬的水環(huán)境中，電負(fù)性原子與另一個(gè)電負(fù)性原子之間以共價(jià)方式結(jié)合形成弱相互作用的氫鍵，兩電負(fù)性原子不等分配，一個(gè)為氫供體，另一個(gè)為氫受體。氫鍵的強(qiáng)弱與原子的電負(fù)性或半徑大小有關(guān)，電負(fù)性越大，半徑越小則氫鍵作用越強(qiáng)。在實(shí)際水環(huán)境中氫鍵的種類會(huì)因?yàn)樵臃N類的不同而不同，最多的是水分子之間的(O-H…O-)氫鍵，鍵能為18.8 kJ/mol。圖3反映了模擬過程中從水分子到配體分子的距離來間接表示氫鍵的作用域[9]，該圖清晰地表明在整個(gè)分子動(dòng)力學(xué)模擬期間，陸續(xù)會(huì)有不同水分子(其中包含晶體結(jié)晶水)與配體匹配，形成穩(wěn)定的氫鍵作用，當(dāng)然在約1 510-1 520(10 ps)之間氫鍵網(wǎng)絡(luò)有稍微缺失，即存在一個(gè)較弱的氫鍵作用，而此時(shí)配體與pocket的構(gòu)象有較高模糊度[10]。

圖2 A蛋白鏈在模擬時(shí)RMSD值Fig.2 RMSD value of the A protein chain in simulation

在Bromodomains的結(jié)構(gòu)特征中，由于有兩個(gè)高度保守的袢環(huán)結(jié)構(gòu)(ZA、BC環(huán))，同時(shí)還有一定數(shù)量的結(jié)晶水分子，這些水分子與配體之間的相互作用，促進(jìn)Bromodomain識(shí)別配體并與其結(jié)合。在分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中，以配體N末端(O1-C1-NE-CE)四個(gè)原子組成的二面角構(gòu)象隨著蛋白鏈的擺動(dòng)而發(fā)生變化，但是構(gòu)象整體處于穩(wěn)定狀態(tài)。通過可視化軟件VMD，可清晰看到有1個(gè)高度保守的氨基酸分子：Pro66與配體ACK之間形成緊密的非鍵相互作用，同時(shí)在整個(gè)分子動(dòng)力學(xué)模擬期間持續(xù)有不同的氨基酸分子與配體保持較小距離，并持續(xù)發(fā)生分子間作用[11]，具體情形如下圖4所示。圖4是分子動(dòng)力學(xué)模擬前后結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)圖，圖中脯氨酸分子Pro66在配體(黃色ACK)右下方穩(wěn)定地存在著，且兩分子之間的距離小于5 ?。

3 討 論

在分析蛋白識(shí)別氨基酸機(jī)制時(shí)，研究者通常以蛋白-蛋白反應(yīng)機(jī)理為基礎(chǔ)，而對(duì)蛋白或氨基酸自身幾何結(jié)構(gòu)的分析也是研究的重點(diǎn)[12]。對(duì)Bromodomain結(jié)合位點(diǎn)的幾何結(jié)構(gòu)進(jìn)行FCTM分析，pocket的凹凸性分?jǐn)?shù)為60，該結(jié)果說明該Bromodomain的結(jié)合位點(diǎn)具有高凹性，這就使得其識(shí)別配體時(shí)表現(xiàn)敏感，同時(shí)其alphaspace值為131也表明結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部容積較大，這些都是識(shí)別配體的有利條件,也間接地表示該保守結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定結(jié)合配體的較高可能性。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示：模擬過程中配體受到的來自結(jié)合位點(diǎn)表面脯氨酸(Pro66)分子的持續(xù)分子間作用，同時(shí)pocket內(nèi)的水分子分布在配體周圍并對(duì)其給予氫鍵網(wǎng)絡(luò)的作用，這些都是配體能被Bromodomain識(shí)別并且無法逃離的重要原因。

圖4 結(jié)合位點(diǎn)表面氨基酸分子對(duì)配體的作用力Fig.4 Force from amino acid molecules on the binding site to ligand

4 結(jié) 論

綜上兩種方法得到的結(jié)果，該Bromodomain識(shí)別乙?；嚢彼岵⑴c之穩(wěn)定結(jié)合的關(guān)鍵因素有兩個(gè)：

1)蛋白結(jié)構(gòu)域自身結(jié)合位點(diǎn)的幾何結(jié)構(gòu)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2)結(jié)合位點(diǎn)表面氨基酸分子和內(nèi)部水分子對(duì)配體的持續(xù)分子間作用對(duì)配體有著重要影響。