DPYD、ABCB1、GSTP1、ERCC1基因多態(tài)性與晚期結(jié)腸癌臨床特征、不良反應(yīng)、預(yù)后的關(guān)系

茍苗苗 張勇 千年松 司海燕 高云鶴 陳凜 戴廣海

大腸癌在我國(guó)發(fā)病率逐年上升，是我國(guó)發(fā)病率和死亡率第3的癌種［1］。隨著化療藥物及靶向藥物的出現(xiàn)，晚期大腸癌患者的生存時(shí)間延長(zhǎng)［2-3］。以西妥昔單抗和貝伐珠單抗聯(lián)合奧沙利鉑、氟尿嘧啶類(lèi)及伊立替康藥物為主的化療方案成為晚期大腸癌的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案［4-5］。雖然晚期腸癌患者的總生存時(shí)間（overall survival，OS）最長(zhǎng)達(dá)到40個(gè)月，但部分患者因無(wú)法耐受化療不良反應(yīng)或發(fā)生原發(fā)性耐藥或者繼發(fā)性耐藥而停止治療。在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)即使大腸癌患者單純接受相同化療方案相同藥物劑量治療時(shí)，在治療療效和耐受性方面也存在較大的個(gè)體差異。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)關(guān)于藥物DNA損傷修復(fù)、藥物代謝和解毒等基因存在單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphisms，SNPs）［6-7］，這些多態(tài)性影響不同個(gè)體對(duì)藥物的敏感性和毒性。關(guān)于晚期大腸癌的基因多態(tài)性相關(guān)文獻(xiàn)分子機(jī)制尚不明確，且說(shuō)法不一，有待進(jìn)一步研究。本研究是通過(guò)Life平臺(tái)檢測(cè)基因技術(shù)檢測(cè)晚期腸癌的基因多態(tài)性，分析其與臨床特征、奧沙利鉑和氟尿嘧啶為主方案不良反應(yīng)和預(yù)后的關(guān)系，從而個(gè)體化管理患者的治療方案和劑量，預(yù)防嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生和預(yù)測(cè)生存。

資料與方法

一、研究設(shè)計(jì)

收集2016年3月至2018年5月在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院腫瘤治療中心初治的108 例晚期結(jié)腸癌患者化療前晨起外周血。其中男性患者70例，女性患者38例，年齡34～75歲，中位年齡53歲，所有患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為結(jié)腸癌患者。所有患者均存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，初治時(shí)體力狀態(tài)評(píng)分（performance score，PS）≤2分，可耐受化療。

二、化療方案與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

所有患者均接受以?shī)W沙利鉑和氟尿嘧啶為主的一線化療：L-OHP 85 mg/m2，靜滴 2 h，d1；CF 200 mg/m2，靜滴 2 h，d1～d5；5-Fu 400 mg/m2，靜滴 4 h，5-Fu 600 mg/m2，泵入 46 h；每 2 周重復(fù)，或者 L-OHP 130 mg/m2，靜滴 2 h，d1；Xeloda 1.5g po bid，d1～d14。每 3 周重復(fù)。

臨床評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)直腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)采用第七版AJCC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。108例晚期大腸癌患者應(yīng)用以?shī)W沙利鉑和氟尿嘧啶的化療方案，每2或3周期進(jìn)行影像學(xué)評(píng)估，使用實(shí)體腫瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)RECIST1.1版，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）、疾病進(jìn)展（progression disease，PD）。病情進(jìn)展后更換方案，所有患者均觀察無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS），即從首次化療開(kāi)始至證實(shí)病情進(jìn)展時(shí)間。不良反應(yīng)包括骨髓抑制、腹瀉、神經(jīng)毒性、乏力、口腔黏膜潰瘍、消化道反應(yīng)、皮膚色素沉著等?；熀蠖拘苑磻?yīng)根據(jù)常見(jiàn)不良事件評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（CTCAE）評(píng)估。不良反應(yīng)的收集基于整體化療周期中最高級(jí)別記錄。

三、檢測(cè)方法

Life平臺(tái)檢測(cè)是泛生子通過(guò)自主專(zhuān)利One Step Seq技術(shù)進(jìn)行建庫(kù)，后續(xù)通過(guò)Ion proton測(cè)序系統(tǒng)完成上機(jī)測(cè)序。1. One Step Seq 建庫(kù)：（1）將本公司設(shè)計(jì)的 One Step Seq擴(kuò)增引物、barcode引物、待檢測(cè)的DNA模板、酶按SOP要求混合成所需的擴(kuò)增體系；（2）一步法PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增；（3）PCR結(jié)束后使用磁珠純化產(chǎn)物，去掉引物二聚體， 通過(guò)質(zhì)控后，得到滿足上機(jī)要求的文庫(kù)。2.上機(jī)測(cè)序：使用 Ion Torrent? Ion Proton 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。（1）文庫(kù)經(jīng)過(guò)油包水PCR過(guò)程完成模板富集純化，形成測(cè)序微珠；（2）將測(cè)序微珠加載到測(cè)序芯片上；（3）在proton測(cè)序儀上完成對(duì)測(cè)序芯片的檢測(cè)使用Ion Proton測(cè)序系統(tǒng)，測(cè)序過(guò)程只需2.5 h即可完成，并且能夠自動(dòng)給出分析結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SNP基因多態(tài)性分布情況經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì) 108例患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，用Kaplan-meier法計(jì)算生存曲線，用Log-rank檢驗(yàn)比較不同基因型的PFS（即生存時(shí)間）差異。

結(jié) 果

一、基因分型及臨床特征

108例晚期腸癌患者納入檢測(cè)，共檢測(cè)了DPYD、ABCB1、GSTP1、ERCC1等4個(gè)基因。其 中 DPYD 4個(gè)位 點(diǎn)（rs3918290、rs55886062、rs67376798、rs2297595）均為野生型，該樣本不符合遺傳平衡檢驗(yàn)。ERCC1rs11615基因頻率分別為：AA野生型5.6%（6/108），AG雜合型46.3%（50/108），GG純和突變型48.1%（52/108），經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)（χ2=0.928，P=0.335），該樣本達(dá)到了遺傳平衡。GSTP1基因頻率分別為：野生型61.1%（66/108），雜合型33.3%（36/108），純和突變型5.6%（6/108），經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)（χ2=0.069，P=0.793），該樣本達(dá)到了遺傳平衡。ABCB1基因頻率分別為：野生型7.4%（8/108），雜合型53.7%（58/108），純和突變型38.9%（42/108），經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)（χ2=1.996，P=0.158），該樣本達(dá)到了遺傳平衡?；蚍中鸵?jiàn)表1。

表1 ERCC1、GSTP1、ABCB1基因多態(tài)性頻率分布（例，%）

結(jié)合患者臨床特征，觀察KRAS狀態(tài)和原發(fā)灶的位置與基因分布頻率的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤位于左右半結(jié)腸與ERCC1基因分布有關(guān)（χ2=4.802，P=0.028），與GSTP1、ABCB1基因分布頻率無(wú)關(guān)（χ2=3.691；P=0.055；χ2=1.812，P=0.178）。在92例KRAS狀態(tài)明確的患者中，KRAS突變型患者ABCB1 AG雜合突變率42.9%，KRAS野生型AG雜合突變率為72.7%，兩者差異具有統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（χ2=3.939，P=0.047），ERCC1，GSTP1基因分布頻率與KRAS基因狀態(tài)無(wú)關(guān)（χ2=3.495，P=0.062；χ2=0.703，P=0.402）。見(jiàn)表2。

表2 ERCC1、GSTP1、ABCB1基因多態(tài)性與KRAS基因狀態(tài)、左右半部位的關(guān)系（例）

二、不同基因頻率與不良反應(yīng)之間的關(guān)系

ERCC1不同基因頻率與不良反應(yīng)無(wú)關(guān)（χ2=0，P=0.984）， 而 GSTP1 AG 型和 GG 型較 AA 型易產(chǎn)生 2～3級(jí)全身不良反應(yīng)（77.8% vs. 45.5%，χ2=5.193；P=0.023）。ABCB1 GG 型和 AA 型 患者發(fā)生3～4級(jí)不良反應(yīng)率為32.9%，對(duì)比AG型患者發(fā)生3～4級(jí)不良反應(yīng)率為62.1%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.862，P=0.027）。見(jiàn)表3。

表3 ERCC1、GSTP1、ABCB1基因多態(tài)性與不良反應(yīng)之間的關(guān)系

三、不同基因型與預(yù)后關(guān)系

隨訪108患者化療后中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（PFS），中位PFS與ABCB1和GSTP1基因多態(tài)性無(wú)關(guān)（P=0.501，P=0.191），與ERCC1不同基因型有關(guān)，ERRC1雜合型突變（AG型）患者較純和型（GG型＋AA型）具有較短PFS（5.6 m vs. 8.0 m，P=0.029）（圖1）。

圖1 ERCC1基因突變類(lèi)型與中位無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）關(guān)系

討 論

ERCC1是哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA修復(fù)系統(tǒng)途徑中的一種重要的酶，與XPF形成復(fù)合物切開(kāi)受損DNA鏈的5′端，XPG切開(kāi)受損DNA鏈的3端，從而切除受損的片段［8］。ABCB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（ATP binding cassette transporter super family）是一大類(lèi)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要功能是利用ATP水解產(chǎn)生的能量將與其結(jié)合的底物包括化學(xué)物質(zhì)和藥物等主動(dòng)泵出細(xì)胞外。ABCB1［9］又稱(chēng)為多藥耐藥基因，編碼P-糖蛋白（P-gp），多種化療藥物與P-gp結(jié)合泵出細(xì)胞外。GSTP1為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutahione S-trans-ferase，GST）P1是參與外來(lái)化學(xué)物質(zhì)解毒和致癌物質(zhì)代謝滅活的多功能藥物代謝酶，它可以通過(guò)防止DNA損傷和DNA復(fù)合物形成參與奧沙利鉑等鉑類(lèi)抗癌藥物的代謝，但同時(shí)其基因多態(tài)性也可以造成腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的耐藥［9］。晚期腸癌化療藥物主要是奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類(lèi)藥物或伊立替康聯(lián)合氟尿嘧啶類(lèi)藥物。上述基因均參與腸癌化療藥物代謝、功能等。因DPYD不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，未納入后續(xù)研究。

腸癌靶向治療聯(lián)合化療的時(shí)代，研究著爭(zhēng)論靶向藥物如何與化療更好的配伍和選擇?！白笥野搿敝疇?zhēng)是2015以來(lái)最熱議的話題之一。首先明確了的一個(gè)觀點(diǎn)就是腫瘤部位是Ⅲ/Ⅳ期結(jié)直腸癌獨(dú)立的預(yù)后因素［5］，右半結(jié)腸癌預(yù)后顯著差于左半結(jié)腸和直腸，與治療手段無(wú)關(guān)［2］。其次，原發(fā)瘤部位是EGFR靶向治療的負(fù)性療效預(yù)測(cè)指標(biāo)［5］。大多數(shù)研究者認(rèn)為左右半結(jié)腸在胚胎起源、解剖學(xué)供應(yīng)、腫瘤的臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致了更重要的分子生物學(xué)特征的差異［10-12］。基因多態(tài)性的頻率分布是否與腫瘤原發(fā)部位左右半腸癌相關(guān)，是否影響了腫瘤的治療及預(yù)后，關(guān)于這部分目前沒(méi)有報(bào)道。本研究探索了與腸癌化療藥物相關(guān)的ERCC1，ABCB1，GSTP1基因多態(tài)性與腫瘤部位的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤位于左右半結(jié)腸與ERCC1基因分布有關(guān)，與GSTP1、ABCB1基因分布頻率無(wú)關(guān)。右半腸癌ERCC1的AG型雜合突變率為40.0%，而該基因在左半腸癌AG型雜合突變率為60%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ERCC1［8］與奧沙利鉑、氟尿嘧啶類(lèi)藥物化療后導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)有關(guān)，對(duì)于ERCC1突變類(lèi)型與化療療效的關(guān)系說(shuō)法不一。本研究結(jié)果提示左右半腸癌ERCC1基因突變頻率存在差異，這也從基因?qū)用孢M(jìn)一步驗(yàn)證左右半腸癌患者在生物學(xué)特征方案存在更多的差異，導(dǎo)致左右半腸癌預(yù)后結(jié)果不同。KRAS狀態(tài)也是影響腸癌預(yù)后的重要因素［13］，同時(shí)KRAS突變患者無(wú)法從西妥昔單抗中獲益。92例KRAS狀態(tài)明確的晚期腸癌患者中，KRAS突變患者ABCB1 AG雜合突變率42.9%，KRAS野生型AG雜合突變率為72.7%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.939，P=0.047），這也提示KRAS突變患者部分藥物基因多態(tài)性存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致藥物的代謝濃度或耐藥性方面發(fā)生改變，從而影響生存時(shí)間。還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量再次驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異的基因的多態(tài)性分布。

本研究結(jié)果顯示，晚期腸癌患者應(yīng)用奧沙利鉑和氟尿嘧啶類(lèi)藥物的化療方案時(shí)，GSTP1 AG型和GG型較AA型易產(chǎn)生2～3級(jí)全身不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)高，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能是GSTP1 r1695由A到G的改變導(dǎo)致了編碼氨基酸的改變，蛋白功能性下降，使得藥物代謝排毒的能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致毒副作用增強(qiáng)。GSTP1在晚期腸癌的化療毒副反應(yīng)方面的研究相對(duì)較少，但這個(gè)現(xiàn)象在乳腺癌［14］、肺癌［15］研究中得到了驗(yàn)證。ABCB1 AG型患者發(fā)生3～4級(jí)不良反應(yīng)率為62.1%，明顯高于其他組。目前關(guān)于ABCB1的研究大多數(shù)在乳腺癌中。有報(bào)道顯示使用紫杉類(lèi)藥物的患者檢測(cè)ABCB1（3435T＞C）野生純合型（TT型）患者發(fā)生血液學(xué)毒性的風(fēng)險(xiǎn)高于其他基因型［16］。另有研究表明［17］ABCB1 2677G＞T/A基因多態(tài)性可能與乳腺癌患者AC聯(lián)合化療所致嚴(yán)重中性粒細(xì)胞減少癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。這些在乳腺癌中的結(jié)論似乎與本研究中的結(jié)論不一致，可能原因是這些基因產(chǎn)生的功能蛋白在各個(gè)癌種中不同化療藥物中作用機(jī)制不一致。一項(xiàng)關(guān)于腸癌的研究是Eva Gonzalez-Haba等人發(fā)現(xiàn)ABCB1基因的單核苷酸多態(tài)性與卡培他濱和5-Fu的不良反應(yīng)相關(guān)，基因型為rs1045642（C3435T）的患者使用卡培他濱治療時(shí)發(fā)生手足綜合征也明顯降低（P=0.033），但使用5-Fu治療發(fā)生腹瀉則明顯增加（P=0.035）［18］。通過(guò)對(duì)晚期腸癌患者基因多態(tài)性的檢測(cè)，可以預(yù)測(cè)患者應(yīng)用化療后發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，為臨床安全用藥提供了一定依據(jù)。有望根據(jù)本研究所得結(jié)論，提出針對(duì)性的預(yù)防方案，從而保障患者用藥安全。

目前研究最多的還是基因多態(tài)性與腫瘤治療預(yù)后的關(guān)系。呂紅英等［19］研究GSTP1基因多態(tài)性與晚期肺癌鉑類(lèi)化療療效和生存，發(fā)現(xiàn)GSTP1 A/G＋G/G基因型的中位生存時(shí)間為8.0個(gè)月，A/A基因型為6.0個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.688，P＜0.01）；沈冬亞等［20］研究GSTP1，ERCC1基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌FOLFOX化療方案療效相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)患者性別、年齡、結(jié)直腸癌分期（TNM）及腫塊部位等和FOLFOX化療療效均無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），GSTP1單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌對(duì)FOLFOX方案化療療效相關(guān)。梁軍等［21］研究發(fā)現(xiàn)99例晚期大腸癌患者中位TTP為7個(gè)月，ERCC1C/C基因型患者中位TTP為10個(gè)月，C/T＋T/T型患者中位TTP為5個(gè)月，二者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。本研究中ERRC1雜合型突變（AG型）患者較純和型（GG型＋AA型）具有較短 PFS（5.6 m vs. 8.0 m，P=0.029）。這個(gè)結(jié)果和梁軍等人的研究結(jié)果相似。Park等［22］解釋該現(xiàn)象可能是因?yàn)锳等位基因攜帶者的ERCC1mRNA水平更高，DNA修復(fù)能力更強(qiáng)，這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的GG基因型患者有較好的化療反應(yīng)相一致。本研究中ABCB1和GSPT1與患者中位PFS無(wú)關(guān)，考慮ERCC1與奧沙利鉑修復(fù)相關(guān)，ABCB1和GSTP1不僅與奧沙利鉑相關(guān)，還與氟尿嘧啶類(lèi)藥物的代謝有關(guān)，所以ERCC1的基因多態(tài)性更能單純反映化療的療效。

綜上所述，結(jié)合ERCC1、GSTP1、ABCC1的基因多態(tài)性和臨床特征及化療方案，從遺傳信息標(biāo)記物層面更多的評(píng)估不良反應(yīng)與預(yù)后，為結(jié)直腸癌個(gè)體化、精確化治療提供可行的理論依據(jù)。