黔東南地區(qū)地中海貧血基因診斷結(jié)果分析

龍麗 楊彪 侯小良 付敏

【摘要】 目的：探討分析黔東南地區(qū)地中海貧血患者的基因型檢測結(jié)果。方法：收集2016年10月-2018年10月在黔東南州人民醫(yī)院行地中海貧血篩查的1 099例各科室住院患者的資料，通過血常規(guī)、血紅蛋白電泳進(jìn)行相應(yīng)的篩查，通過多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和反向斑點雜交技術(shù)相結(jié)合的方法對地中海貧血進(jìn)行基因檢測。結(jié)果：收集的1 099例標(biāo)本中，共檢測出地中海貧血457例，檢出率為41.58%（457/1 099），其中α-地中海貧血205例，12種基因突變類型，占44.86%（205/457），--SEA/αα所占比例最高，為65.85%（135/205），其余類型少見。檢測出β-地中海貧血為241例，占52.74%（241/457），14種突變型，其中βCD41-42/βN的基因型比例最高，為60.17%（145/241）。另外，還檢測出11例αβ復(fù)合型地中海貧血基因型，占2.41%（11/457）。結(jié)論：黔東南地區(qū)人群地中海貧血基因型特點為β-地中海貧血>α-地中海貧血>αβ復(fù)合型地中海貧血，其中β-地中海貧血主要為βCD41-42/βN，α-地中海貧血主要為--SEA/αα，這可為臨床遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供相應(yīng)的依據(jù)，減少臨床漏診的發(fā)生，具有一定的臨床意義。

【關(guān)鍵詞】 地中海貧血 基因型 黔東南地區(qū)

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.32.021 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）32-00-03

Genetic Diagnosis of Thalassemia in Southeast of Guizhou Province/LONG Li， YANG Biao， HOU Xiaoliang， FU Min. //Chinese and Foreign Medical Research， 2019， 17（32）： -52

[Abstract] Objective： To explore and analyze the genotype tests results of thalassemia patients in the southeast of Guizhou province. Method： The data of 1 099 inpatients who were screened for thalassemia in genetic diagnosis of thalassemia in Peoples Hospital of Qiandongnan Prefecture from October 2016 to October 2018 were collected. Blood routine examination and hemoglobin electrophoresis were used to screen the patients. The gene of thalassemia was detected by polymerase chain reaction （PCR） and reverse dot blot hybridization. Result： A total of 457 cases of thalassemia were detected in 1 099 samples， and the positive rate was 41.58% （457/1 099）. Among them， 205 cases were alpha thalassemia with 12 gene mutations， accounting for 44.86% （205/457）. The proportion of --SEA/αα was the highest at 65.85% （135/205）， and the other types were rare. There were 241 cases of beta thalassemia， accounting for 52.74% （241/457）， among which βCD41-42/βN genotype was 60.17% （145/241）. In addition， 11 cases alpha beta thalassemia genotypes were detected， accounting for 2.41% （11/457）. Conclusion： The genotypes of thalassemia are beta thalassemia >alpha thalassemia> alpha beta thalassemia， among them βCD41-42/βN is mainly type of the beta thalassemia， and --SEA/αα is mainly type of the alpha thalassemia， which can provide the corresponding basis for clinical genetic counseling and prenatal diagnosis， and reduce the occurrence of clinical missed diagnosis， and has certain clinical significance.

[Key words] Thalassemia Genotype Southeast of Guizhou province

First-authors address： Peoples Hospital of Qiandongnan Prefecture， Kaili 556000， China

地中海貧血（thalassemia），簡稱地貧，是世界上最常見的遺傳性疾病之一，其主要是由于珠蛋白基因的缺失或者點突變導(dǎo)致正常血紅蛋白合成顯著減少或缺失所致，進(jìn)而紅細(xì)胞壽命縮短、破壞加速，引起進(jìn)行性溶血性貧血，又稱為珠蛋白生成障礙性貧血[1]。地中海貧血好發(fā)于地中海地區(qū)、中東地區(qū)、南亞次大陸和東南亞等，而我國的高發(fā)地區(qū)為廣西、廣東及貴州等南部地區(qū)[2-4]。地中海貧血可分為多種類型，其中以α、β-地中海貧血最為多見。地中海貧血患者的臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)多樣性，可無癥狀，也可嚴(yán)重貧血，需終生輸血，并伴有多器官系統(tǒng)的并發(fā)癥[5]。隨著醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)的發(fā)展和不斷進(jìn)步，使得地中海貧血各型相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)得到準(zhǔn)確快速的測定，臨床上采用多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和反向斑點雜交技術(shù)相結(jié)合的方法，大大地提高了診斷疾病的準(zhǔn)確性，實現(xiàn)人群中篩查疾病的可能，起到預(yù)防中度地貧和重度地貧的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年10月-2018年10月在黔東南州人民醫(yī)院行地中海貧血篩查的1 099例各科室住院患者為研究對象，并且收集其一般資料。研究對象中，男384例，女715例，年齡26 d～80歲。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，患者均已簽署知情同意書。

1.2 α、β-地貧篩查方法

取受檢者EDTA-K2抗凝血2 ml，采用紅細(xì)胞平均體積（erythrocyte mean corpuscular volume，MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）及血紅蛋白（Hb）相結(jié)合的方式進(jìn)行篩查，MCV<80 fl、MCH<27 pg、Hb<110 g/L為篩查陽性。

1.3 基因檢測方法

標(biāo)本收集：收集上述結(jié)果陽性患者，采用無菌抗凝管（EDTA抗凝劑）抽取外周靜脈血2 ml混勻（標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢），實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)操作;PCR擴(kuò)增：取5 μl抽提好的DNA樣本作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性15 min，進(jìn)入循環(huán)，97 ℃變性50 s，60 ℃復(fù)性 60 s，72 ℃延伸120 s，共35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存，PCR擴(kuò)增采用2720 Thermal Cycler PCR儀（北京伯邁科技有限公司）;擴(kuò)增產(chǎn)物雜交實驗：將95 ℃變性5～10 min，冰水浴2 min的PCR產(chǎn)物，于準(zhǔn)備好的42 ℃雜交儀中，蓋上蓋板溫育30～40 min后開泵進(jìn)行導(dǎo)流雜交，雜交實驗后的膜條放置于酶標(biāo)液中溫育5 min，洗膜后加入0.5 ml顯色液，洗膜后1 h內(nèi)分析結(jié)果，PCR產(chǎn)物雜交實驗采用HB-202A型醫(yī)用核酸分子雜交儀（廣東凱普生物科技股份有限公司）。地中海貧血檢測試劑盒購自廣東凱普生物科技股份有限公司，可同時檢測3種缺失型α-地中海貧血（--SEA、-α3.7和-α4.2）、3種突變型α-地中海貧血（αCS、αQS和αWS）及19種突變類型β-地中海貧血[-30（T-C）、-32（C-A）、-28（A-G）、-29（A-G）、Cap+40-43（-AAAC）、Cap+1（A-C）、Int（T-G）、CD14-15（+G）、CD17（A-T）、CD27-28（+C）、 βE（G-A）、CD31（-C）、CD41-42（-TCTT）、CD43（G-T）、CD71-72（+A）、IVS-Ⅰ-1（G-T，G-A）、IVS-Ⅰ-5（G-C）、IVS-Ⅱ-654（C-T）]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

將收集的數(shù)據(jù)輸入Excel軟件中進(jìn)行處理，構(gòu)成比采用率（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 α-地中海貧血基因檢測結(jié)果

研究共檢測出457例地中海貧血患者，檢出率為41.58%（457/1 099）。其中確診為α-地中海貧血的患者205例，占44.86%（205/457），檢出靜止型α-地中海貧血45例，占21.95%（45/205），標(biāo)準(zhǔn)型α-地中海貧血138例，占67.32%（138/205），中間型α-地中海貧血22例，占10.73%（22/205），其中，--SEA/αα所占比例最高，為65.85%（135/205），其次是-α3.7/αα占9.76%（20/205）;再次是-α4.2/αα占5.85%（12/205）。其余的類型ααCS/αα、--SEA/-α4.2、--SEA/-α3.7、

2.2 β-地中海貧血基因檢測結(jié)果

確診的241例β-地中海貧血，占52.74%（241/457），共檢測出14種β-地中海貧血基因突變型，依次為βCD41-42/βN、βCD17/βN、βIVS-Ⅱ-654/βN、βCD-28M/βN、βCD-29M/βN、βCD41-42/βCD41-42、βCD17/βCD43、βCD27-28/βN、βCD-29M/βCD27-28、βCD41-42/βCD14-15、βCD41-42/βCD17、βCD41-42/βCD27-28、βCD41-42/βIVS-Ⅱ-654、βCD71-72/βN。其中βCD41-42/βN的基因型比例最高，為60.17%（145/241），其次為βCD17/βN，占24.48%（59/241），而βCD17/βCD43、βCD27-28/βN、βCD-29M/βCD27-28、βCD41-42/βCD14-15、βCD41-42/βCD17、βCD41-42/βCD27-28、βCD41-42/βIVS-Ⅱ-654、βCD71-72/βN基因型所占比例最少均為0.41%（1/241），見表2。

2.3 αβ復(fù)合型地中海貧血患者常見基因型分布情況

通過基因檢測結(jié)果為αβ復(fù)合型地中海貧血的患者11例，占2.41%（11/457）。其中以--SEA/αα與βCD41-42/βN復(fù)合型、-α3.7/αα與βCD41-42/βN復(fù)合型常見，分別占27.27%（3/11），其他類型少見，所占比例均為9.09%（1/11），見表3。

3 討論

地中海貧血是一種常染色體隱性單基因遺傳病，重型者可致殘致死，目前的治療方法尚不明確，維持生命需要定期的輸血及去鐵治療[6]，給社會和家庭帶來嚴(yán)重的危害，同時影響著世界新生兒的身體素質(zhì)。臨床上根據(jù)患者不同的HbA2和HbF含量可將地中海貧血分為α型、β型、αβ復(fù)合型、δβ型和δ型等，其中以α-和β-地貧較常見[7]。

本研究對黔東南州人民醫(yī)院1 099例地中海貧血篩查受檢者進(jìn)行地中海貧血基因型檢查的陽性率為41.58%（457/1 099），略低于貴州地區(qū)的地中海貧血基因陽性檢出率（46.05%）[8]。通過基因檢測，確認(rèn)α-地中海貧血的患者205例，占44.86%（205/457）;β-地中海貧血患者241例，占52.74%（241/457）;αβ復(fù)合型地中海貧血基因型11例，占2.41%（11/457）。

α-地中海貧血是由α-珠蛋白基因異常，導(dǎo)致α-珠蛋白鏈缺失或減少引起的，其以基因缺失為多見，而基因突變則少見。其本研究結(jié)果顯示，黔東南地區(qū)地中海貧血患者的靜止型α-地中海貧血45例，占21.95%（45/205），基因型分別為-α3.7/αα、-α4.2/αα、αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα;標(biāo)準(zhǔn)型α-地中海貧血138例，占67.32%（138/205），基因型分別為--SEA/αα、-α3.7/-α3.7、-α3.7/-αCSα，又稱輕型α-地中海貧血;中間型α-地中海貧血22例，占10.73%（22/205），基因型分別為--SEA/-αCSα、--SEA/-α3.7、--SEA/-α4.2、--SEA/-αQSα。其中--SEA/αα所占比例最高，為65.85%，其次是-α3.7/αα，再次是-α4.2/αα。其余的類型ααCS/αα、--SEA/-α4.2、--SEA/-α3.7、--SEA/-αCSα、ααQS/αα、-α3.7/-α3.7、ααWS/αα、-α3.7/-αCSα和--SEA/-αQSα較為少見，本次試驗結(jié)果提示，黔東南地區(qū)地中海貧血主要以--SEA/αα型為主，略高于云南地區(qū)的64.00%[9]，但低于廣東東莞73.30%[10]。

β-地中海貧血是指血紅蛋白的珠蛋白鏈合成受部分或完全抑制的遺傳性溶血性貧血，危害最為嚴(yán)重，其突變型多于α-地中海貧血，患兒多數(shù)于出生后3～12個月出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀，靠輸血維持生命。本次研究結(jié)果顯示，241例患者檢測出14種基因突變型，檢測結(jié)果以βCD41-42/βN（60.17%）最常見，與文獻(xiàn)[11]海南地區(qū)60.57%的檢出率相近，但高于文獻(xiàn)[10]南部的廣東（37.04%）和文獻(xiàn)[12]廣西地區(qū)（46.89%）。

αβ復(fù)合型地中海貧血個體與α、β任意一型地中海貧血個體婚配，都可產(chǎn)下危險系數(shù)極大的重型地中海貧血的患兒，所以還需重視αβ復(fù)合型地中海貧血的檢查。本研究還檢測出αβ復(fù)合型地中海貧血基因型11例，其結(jié)果遠(yuǎn)低于廣東地區(qū)8.6%的檢出率[13]，其主要為--SEA/αα與βCD41-42/βN復(fù)合型、-α3.7/αα與βCD41-42/βN復(fù)合型。以上結(jié)果表明，此次研究的黔東南地區(qū)地中海貧血的基因類型，初步了解了地貧患者的基因型，為該地區(qū)育齡人群做好婚前篩查及基因篩查提供了一定的臨床依據(jù)，對減少地中海貧血新生兒的出生率，減輕人類的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高人口素質(zhì)，具有重要的意義。

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（收稿日期：2019-06-22） （本文編輯：何玉勤）