結(jié)直腸腺癌、腺瘤組織及正常組織中黑色素瘤缺乏因子2表達(dá)差異的研究

陳名明，漆家康，羅 斌，李佶松，王 康，

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院普外科，四川 成都 610072)

編碼黑色素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma2，AIM2)的基因最初是在人類黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[1]，AIM2作為一種內(nèi)源性免疫受體，研究發(fā)現(xiàn)AIM2在結(jié)腸癌[1～3]、前列腺癌[4]中表達(dá)降低，而在鼻咽癌[5，6]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[7]和肺腺癌[8]中表達(dá)增加。AIM2在一系列腫瘤組織中的差異表達(dá)表明它可能在不同類型的癌癥中具有獨(dú)特的作用。AIM2在結(jié)直腸癌中可發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[2，3]。已經(jīng)在結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中觀察到AIM2的表達(dá)減少和頻移的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性[9]。與那些AIM2表達(dá)水平較高的大腸癌患者相比，AIM2表達(dá)水平降低的大腸癌患者的預(yù)后較差[9]。繼往兩項(xiàng)研究證明AIM2獨(dú)立于炎癥小體來預(yù)防結(jié)直腸癌[2，3]。這兩項(xiàng)研究都發(fā)現(xiàn)Aim2-/-小鼠在給予氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)和葡萄糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的結(jié)腸炎、息肉和更高的腫瘤負(fù)荷[2，3]。

結(jié)直腸腺瘤是臨床上常見的良性腫瘤，據(jù)報(bào)道有超過95%的結(jié)直腸癌是通過腺瘤-癌轉(zhuǎn)變而來[11]。最新專家共識(shí)已經(jīng)將結(jié)直腸腺瘤定義為癌前病變[12]。目前對(duì)于AIM2基因在結(jié)直腸腺瘤的研究很少，而結(jié)直腸正常組織-腺瘤-癌轉(zhuǎn)變過程的具體機(jī)理仍不明確。本研究通過檢測AIM2在結(jié)直腸癌患者的正常組織、癌組織、腺瘤組織及單純結(jié)直腸腺瘤患者的腺瘤組織中的表達(dá)情況，探究AIM2是否是結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生以及發(fā)展為結(jié)直腸癌的抑制因子。

1 資料與方法

1.1一般資料納入2016年11月至2017年9月四川省人民醫(yī)院收治的52例結(jié)直腸腺癌同時(shí)合并腺瘤的患者，獲取手術(shù)切除標(biāo)本中的癌組織、腺瘤組織及癌旁正常組織標(biāo)本各52份，納入2016～2018年78例結(jié)直腸腺瘤患者，獲取手術(shù)或內(nèi)鏡切除的腺瘤標(biāo)本78例。

1.2方法將獲取組織的標(biāo)本石蠟塊烘烤后通過二甲苯中脫蠟，再將載玻片依次放置于不同濃度梯度的酒精里水化。然后放置于含有檸檬酸鈉抗原修復(fù)液的壓力鍋中修復(fù)抗原。冷卻后將玻片放置于3%過氧化氫溶液中，然后放置于蘇木素復(fù)染液中進(jìn)行復(fù)染，復(fù)染后滴加第一抗體(AIM2∶抗體稀釋液=1∶1200)，放置于4 ℃的恒溫箱中過夜。之后滴加EnVision二抗后將切片放置于37 ℃的恒溫箱中約30 min。滴入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑5～10 min后蒸餾水充分沖洗。將玻片按照酒精濃度梯度依次放入酒精瓶中脫水。取出后用風(fēng)干玻片，中性樹脂封片膠封片后顯微鏡下觀察。

1.3判讀標(biāo)準(zhǔn)通過放大10×40倍的電子顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野將染色分為4個(gè)等級(jí)并分別計(jì)分(0分=無染色，1分=弱染色，2分=適度染色，3分=強(qiáng)染色)，此外將每個(gè)視野的陽性細(xì)胞百分比分為5類(0分為<5%，1分為5～25%，2分為25%～50%，3分為50%～75%，4分為75%～100%)，然后將兩項(xiàng)得分相乘得出最終染色強(qiáng)度得分。0分=陰性(-)，1～4分=低表達(dá)(+)，5～8分=中表達(dá)(++)，9～12分=高表達(dá)(+++)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。本研究等級(jí)資料的兩個(gè)樣本(或多個(gè)樣本)比較運(yùn)用秩和檢驗(yàn)(染色結(jié)果用0=“-”，1=“+”，2=“++”，3=“+++”進(jìn)行編號(hào)后計(jì)算)，相關(guān)性分析運(yùn)用Spearman秩相關(guān)分析法，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，α=0.05，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組組織進(jìn)行兩兩比較，為控制多重比較會(huì)增大犯Ⅰ型錯(cuò)誤概率采用Bonferroni法調(diào)整α水準(zhǔn)，調(diào)整后α’=0.05/3=0.017，P< 0.017視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1AIM2在四種組織中表達(dá)情況AIM2主要在結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，特異性免疫組化染色后呈淡黃色、棕黃色、棕褐色。如圖1。

圖1 幾種不同組織中AIM2的表達(dá)情況 a：結(jié)直腸癌患者的正常組織中AIM2高表達(dá)(×400倍)；b：單純腺瘤組織中AIM2低表達(dá)(×400倍)；c：結(jié)直腸癌患者的癌組織中AIM2無表達(dá)(×400倍)

2.2四種組織AIM2表達(dá)情況的比較結(jié)直腸癌患者的癌組織、腺瘤組織、癌旁正常組織及單純結(jié)直腸腺瘤患者腺瘤組織的AIM2免疫組化染色評(píng)分比較，見表1。

表1 四組組織樣本中黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)免疫組化染色結(jié)果 (n)

2.3四種組織中AIM2免疫組化染色具體比較四種組織中AIM2免疫組化染色評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=26.048，P< 0.01)。免疫組化結(jié)果提示AIM2的表達(dá)，結(jié)直腸癌患者的正常組織>結(jié)直腸腺瘤患者的腺瘤組織>結(jié)直腸癌患者的腺瘤組織>結(jié)直腸癌患者的癌旁組織。

3 討論

本研究通過對(duì)結(jié)直腸癌患者的正常組織、癌組織、腺瘤組織及單純結(jié)直腸腺瘤患者的腺瘤組織中AIM2基因的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AIM2在正常組織中表達(dá)水平最高，癌組織中表達(dá)水平最低，腺瘤組織中表達(dá)水平介于兩者之間，和繼往AIM2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織的研究一致[13]。值得注意的是，由于樣本量有限，單純腺瘤組織與結(jié)直腸癌患者的腺瘤組織中AIM2表達(dá)水平雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但前者AIM2表達(dá)豐度仍有高于后者的趨勢。大量研究發(fā)現(xiàn)AIM2基因可抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[2，3]，但在結(jié)直腸腺瘤中研究很少，本研究提示AIM2基因還可能抑制結(jié)直腸癌的癌前病變，即腺瘤的發(fā)生及其向腺癌的發(fā)展，個(gè)中機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)多種慢性炎癥，包括感染性和非感染性(或特發(fā)性)炎癥都可參與結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生[15]。腺瘤性結(jié)腸息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)基因發(fā)生突變可伴隨結(jié)直腸粘膜細(xì)胞的極性和細(xì)胞間的緊密連接丟失，腸道菌群入侵導(dǎo)致粘膜細(xì)胞持續(xù)損傷并合成炎性細(xì)胞因子IL-23/IL-17前體，促進(jìn)結(jié)直腸腺瘤的形成。局部持續(xù)炎癥使KRAS，TP53基因更易突變，結(jié)直腸腺瘤進(jìn)一步發(fā)展為腺癌[14]。AIM2是識(shí)別微生物或宿主來源的雙鏈DNA的細(xì)胞質(zhì)傳感器。在與DNA結(jié)合后，AIM2組裝成蛋白復(fù)合體即AIM2炎性小體，激活半胱天冬酶-1(Caspase-1)，導(dǎo)致細(xì)胞的炎癥壞死(細(xì)胞焦亡)，并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18合成[2]。黏膜屏障受損導(dǎo)致的慢性炎癥是腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤的始動(dòng)和持續(xù)促進(jìn)因素。慢性炎癥可導(dǎo)致基因不穩(wěn)定和基因突變，均可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[16]。我們推測AIM2可能參與結(jié)直腸炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)抑制結(jié)直腸腺瘤及腺癌的發(fā)生，具體機(jī)制仍需深入研究。