一種可促進(jìn)重組蛋白表達(dá)量和穩(wěn)定性的多功能純化標(biāo)簽的開發(fā)與利用

趙偉欣，劉松，劉立明，陳堅(jiān)，堵國成

?

一種可促進(jìn)重組蛋白表達(dá)量和穩(wěn)定性的多功能純化標(biāo)簽的開發(fā)與利用

趙偉欣，劉松，劉立明，陳堅(jiān)，堵國成

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

趙偉欣, 劉松, 劉立明, 等. 一種可促進(jìn)重組蛋白表達(dá)量和穩(wěn)定性的多功能純化標(biāo)簽的開發(fā)與利用. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(4): 626–635.Zhao WX, Liu S, Liu LM, et al. Development of a purification tag to produce thermostable fused protein. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 626–635.

自組裝雙親短肽(Self-assembling amphipathic peptides，SAPs) 是一類親疏水氨基酸按一定規(guī)律分布、具有自聚合效應(yīng)的短肽，融合在酶蛋白N端時(shí)，具有促進(jìn)表達(dá)和穩(wěn)定化的功能。根據(jù)前期研究結(jié)論，設(shè)計(jì)一條全新的基于SAPs (S1w，HNANARARHNANARARHNANARARHNARARAR) 的可促進(jìn)融合蛋白表達(dá)和穩(wěn)定性，并可用于鎳柱親和層析的多功能短肽標(biāo)簽，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，將S1w以PT-linker (PTPPTTPTPPTTPTP)融合在堿性果膠酶(Alkaline polygalacturonate lyase，PGL)、脂肪氧合酶 (Lipoxygenase，LOX) 及綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP) 的N末端時(shí)，與對(duì)應(yīng)的野生型相比，PGL及LOX的粗酶活分別提高了3.1倍和1.89倍，GFP的熒光強(qiáng)度提高了16.22倍。S1w的3種融合酶均可用鎳柱進(jìn)行親和純化，并具有較高的回收率。PGL及LOX在對(duì)應(yīng)的熱處理?xiàng)l件下，與野生型相比，半衰期分別提高了2.16倍和3.2倍。將GFP-S1w在枯草芽孢桿菌及畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌中融合蛋白表達(dá)量提高明顯，但在畢赤酵母中表達(dá)量幾乎沒有改變。說明在原核表達(dá)體系中，S1w可作為一種新型的促表達(dá)、穩(wěn)定化及可純化的多功能標(biāo)簽。

自組裝雙親短肽，融合蛋白，表達(dá)量，熱穩(wěn)定性，純化，表達(dá)宿主

微生物發(fā)酵已逐漸應(yīng)用于多種酶蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)過程中。目前，如何獲得高產(chǎn)量、高穩(wěn)定性及高催化效率的多功能酶蛋白是酶催化工業(yè)應(yīng)用的主要瓶頸問題[1]。雖然通過基因工程和蛋白質(zhì)工程等手段可以對(duì)酶蛋白本身進(jìn)行改造，利用合適的表達(dá)宿主或優(yōu)化培養(yǎng)條件可使得微生物對(duì)酶進(jìn)行高效異源表達(dá)，但實(shí)際生產(chǎn)中還是經(jīng)常面臨著蛋白低可溶表達(dá)、穩(wěn)定性差、催化效率低和難分離純化等諸多問題[2]。利用分子生物學(xué)技術(shù)可以將不同酶分子融合表達(dá)成為符合工業(yè)需求的多功能酶，可應(yīng)用于多功能催化體系的研究中并顯示出重要的理論和應(yīng)用研究價(jià)值[3]。此外，末端融合功能肽的方法對(duì)酶蛋白的表達(dá)量及催化性質(zhì)的改造已取得廣泛顯著成果[4-6]。在無需酶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)信息的條件下進(jìn)行末端融合，可有效促進(jìn)其異源表達(dá)產(chǎn)量及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)[7]。

由親疏水氨基酸按照一定規(guī)律分布組成的自組裝雙親短肽(Self-assembling amphipathic peptides，SAPs) 被Lu等首次應(yīng)用于脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12) 的熱穩(wěn)定性及催化效率改造[5]。其中，來源于酵母Zution蛋白中的SAP (S1，AEAEAKAKAEAEAKAK) 對(duì)環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶[8]、腈水合酶[9]、堿性淀粉酶[10]及堿性果膠酶[11]的蛋白表達(dá)量、熱穩(wěn)定性及催化效率均有一定促進(jìn)作用?；诖?，具有與S1類似氨基酸組成和排布方式的SAP (S11，AEAEAHAHAE AEAHAH)被開發(fā)并應(yīng)用在多個(gè)酶蛋白的異源表達(dá)過程中，其融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量、穩(wěn)定性及催化效率均有所提高，且S11內(nèi)的組氨酸可用于融合酶的鎳柱親和層析，其純化效率較His-tag純化效率明顯提高[12]。S1與S11之間的4個(gè)氨基酸殘基的差異，說明氨基酸組成對(duì)SAPs融合酶表達(dá)量有著重要影響。此外，氨基酸的突變會(huì)引入相應(yīng)密碼子的改變，諸多研究證明密碼子對(duì)異源基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程有重要影響[13-14]。故根據(jù)前期研究結(jié)論，對(duì)SAPs合理的改造和修飾可以進(jìn)一步提高其多功能應(yīng)用效果。

本研究提出一條全新的多功能SAP(S1w，HNANARARHNANARARHNANARARHNARARAR)，其可促進(jìn)重組融合蛋白表達(dá)和穩(wěn)定性，同時(shí)可作為一種用于鎳柱親和層析的多功能蛋白標(biāo)簽。并將其應(yīng)用到堿性果膠酶(Alkaline polygalacturonate lyase，PGL)、脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOX) 及綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP) 中驗(yàn)證其作用效果。此外以GFP為模式蛋白，研究S1w在不同表達(dá)體系(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及畢赤酵母) 中的促表達(dá)功效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌JM109作為質(zhì)粒的克隆宿主。酶/蛋白表達(dá)宿主.BL21(DE3)、枯草芽孢桿菌W600及畢赤酵母GS115由本實(shí)驗(yàn)室保存。

含有PGL表達(dá)基因的質(zhì)粒pET-22b(+)/、含有LOX表達(dá)基因的pET-22b(+)/質(zhì)粒及含有GFP表達(dá)基因的pET-22b(+)/質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存(圖1A)[12]。S1的PGL融合酶(PGL-S1)表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)/-及S11的PGL融合酶(PGL-S11) 表達(dá)質(zhì)粒pET-22b (+)/-由本實(shí)驗(yàn)室保存。pPIC9K質(zhì)粒及pP43NMK質(zhì)粒購于TaKaRa (大連) 公司。

1.1.2 試劑

Prime STAR (HS) DNA高保真聚合酶、DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶及大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒均購于TaKaRa (大連) 公司。異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素、卡那霉素及遺傳霉素G418均購于生工生物工程(上海) 股份有限公司。NuPAGE?Novex?Bis-Tris預(yù)制凝膠及所用標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker購自Life Technologies公司。一步克隆反應(yīng)ClonExpressTMⅡ試劑盒購于南京諾唯贊公司。DNA片段合成、引物合成及測(cè)序由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成。所用相關(guān)底物等均購于Sigma公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 S1w融合酶突變體的構(gòu)建

自組裝雙親短肽S1w (HNANARARHNANA RARHNANARARHNARARAR)連同PT-linker (PTPPTTPTPPTTPTP)的編碼基因由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成并插入至pET-22b(+)/、pET-22b(+)/、pET-22b(+)/的Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)之間，分別獲得PGL-S1w、LOX-S1w和GFP-S1w融合酶的表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)/、pET-22b(+)/和pET-22b(+)/(圖1B)。并將pET-22b(+)/質(zhì)粒作為模板，以表1中所列對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得融合酶的表達(dá)基因片段，并用一步克隆酶融合至線性化的質(zhì)粒pP43NMK及pPIC9K中，獲得在枯草芽孢桿菌及畢赤酵母中的pP43NMK/和pPIC9K/表達(dá)質(zhì)粒(圖1B)。并用引物對(duì)DS-pP43-F/ DS-pP43-R和DS-9K-F/DS-9K-R分別將S1w和PT-linker表達(dá)基因從pP43NMK/和pPIC9K/中缺失，獲得在枯草芽孢桿菌及畢赤酵母中表達(dá)的野生型GFP (圖1A)。

表1 本文所用引物序列表

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.2 大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：挑取單菌落接入種子培養(yǎng)基[7]裝液量為25 mL的三角瓶(250 mL) 中，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按3% (/) 的接種量接入裝液量為25 mL的三角瓶(250 mL) 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37 ℃，當(dāng)600達(dá)到0.6時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)，并同時(shí)調(diào)整溫度到該酶最適宜的誘導(dǎo)溫度下培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件：PGL：IPTG 0.04 mmol/L，30 ℃下培養(yǎng)48 h；LOX：IPTG 1 mmol/L，20 ℃下培養(yǎng)48 h；GFP：IPTG 0.05 mmol/L，25 ℃下培養(yǎng)24 h。

1.2.3 S1w的GFP融合酶在不同表達(dá)宿主中的培養(yǎng)條件

大腸桿菌培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[7]完成?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[15]完成。畢赤酵母菌培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[16]完成。

1.2.4 酶活及熒光檢測(cè)方法

堿性果膠酶(PGL)[17]的酶活測(cè)定方法參照前期研究。

由于脂肪氧合酶(LOX) 為胞內(nèi)表達(dá)，故取一定的菌體，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)清洗2次，用相同體積的緩沖液懸浮(使得600=5)，破壁后，離心取上清液，按照前期研究方法測(cè)定LOX酶活[18]。

綠色熒光蛋白(GFP) 檢測(cè)方法：在避光條件下將熒光樣品進(jìn)行一定的稀釋，采用多功能酶標(biāo)儀(BioTek，Winooski，VT，USA) 進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，緩沖液A (20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.5) 作為空白對(duì)照。

1.2.5 酶/蛋白的分離純化

A液：20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑。

B液：20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑。

20 mmol/L的pH 7.5的磷酸鹽緩沖液配 制方法：190 mL 20 mmol/L NaH2PO4與810 mL 20 mmol/L Na2HPO4均勻混合。

野生型PGL和PGL-S1[17]、野生型LOX[18]的純化分別參照前期研究方法進(jìn)行操作。野生型GFP采用鹽析方法進(jìn)行初步富集和陰離子親和層析進(jìn)行純化，操作過程參照前期報(bào)道[19]。

PGL-S1w、PGL-S11、LOX-S1w及GFP-S1w融合酶采用鎳柱親和層析。含有目的蛋白的胞外發(fā)酵液或胞內(nèi)上清液經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后作為待純化樣品。用緩沖液A以1 mL/min的流速平衡HisTrap 5 mL FF純化柱。將含有重組融合酶樣品以1 mL/min流速上樣，并用緩沖液A洗脫未結(jié)合蛋白，平衡純化柱。將結(jié)合在鎳柱上的蛋白分別用8%的緩沖液B、60%的緩沖液B及100%的緩沖液B進(jìn)行梯度洗脫并收集含有目的蛋白的組分。

所獲得的目的蛋白溶液使用5 mL HiTrap Desalting純化柱用緩沖液A以5 mL/min的流速進(jìn)行脫鹽處理，所得蛋白樣品于4 ℃保存。

1.2.6 蛋白電泳分析及蛋白濃度測(cè)定

SDS-PAGE分析，使用Life Technologies公司預(yù)制膠NuPAGE?Novex?Bis-Tris，操作步驟詳見說明書。以0.1% (/) 考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。

采用Bradford方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)定蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.7 酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定方法

重組PGL及其突變體的熱穩(wěn)定性以60 ℃下的半衰期(1/2，min) 來表示。將純化并除鹽后的PGL用緩沖液A稀釋至一定濃度，在60 ℃下保溫，每隔3 min測(cè)定殘余酶活。

脂肪氧合酶熱穩(wěn)定性測(cè)定方法：將純化后的酶用緩沖液A稀釋到蛋白濃度為100 μg/mL并在50 ℃保溫，間隔測(cè)定殘余酶活，計(jì)算1/2。1/2按照文獻(xiàn)所述方式進(jìn)行擬合計(jì)算[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多功能肽S1vw序列的設(shè)計(jì)

S1類SAPs融合在酶蛋白N端時(shí)具有促進(jìn)融合酶表達(dá)和穩(wěn)定化的功能[12]。前期研究結(jié)果表明[21]，蛋白質(zhì)翻譯過程中，新生肽鏈N端的正電荷氨基酸殘基能與帶負(fù)電的核糖體相結(jié)合，從而減緩蛋白質(zhì)翻譯速率，促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)量。為強(qiáng)化S1類SAPs的促表達(dá)功能，提出S1w短肽，在其中引入不帶電的天冬酰胺殘基(N) 和帶正電荷的精氨酸殘基(R)，使其整體呈現(xiàn)凈電荷為正。常用的組氨酸標(biāo)簽His-tag (HHHHHH) 含有6個(gè)組氨酸，關(guān)于S11的研究結(jié)果顯示[12]，4個(gè)組氨酸殘基即可實(shí)現(xiàn)良好的純化效果，且組氨酸殘基在蛋白質(zhì)分子中均勻分布，可防止其被包埋[22]。故在S1w內(nèi)部均勻插入4個(gè)組氨酸(H)，最終確定S1w的氨基酸序列為HNANARARHNANARA RHNANARARHNARARAR，以期融合在酶蛋白N端時(shí)，既可促進(jìn)融合酶的表達(dá)量和穩(wěn)定性，又可作為鎳柱純化的多功能蛋白標(biāo)簽。

2.2 S1vw融合酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

S1w (HNANARARHNANARARHNANARA RHNARARAR) 是根據(jù)S1及S11序列優(yōu)化而來。為研究其對(duì)不同酶蛋白的表達(dá)量、穩(wěn)定性等的影響，本研究構(gòu)建PGL、LOX及GFP的S1w融合酶突變體(圖1)，在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。并將GFP-S1w在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，比較其表達(dá)量差異。研究S1w針對(duì)不同酶/蛋白和S1w在不同表達(dá)系統(tǒng)的普適性應(yīng)用效果。

2.3 S1vw對(duì)不同酶/蛋白表達(dá)量的影響

在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，PGL胞外表達(dá)，而LOX和GFP胞內(nèi)表達(dá)。分別測(cè)定PGL的胞外酶活、LOX的胞內(nèi)酶活和GFP表達(dá)菌的全細(xì)胞熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖2所示，分別在3種酶/蛋白的N端融合S1w后，融合酶/蛋白的表達(dá)量明顯提高。PGL的融合酶(PGL-S1w) 的胞外酶活提高至原野生型PGL的3.1倍，與PGL-S1和PGL-S11相比，分別提高了1.2倍和0.95倍，說明相較于S1和S11，S1w促表達(dá)效果更佳。LOX的融合酶(LOX-S1w) 的胞內(nèi)酶活較野生型提高了1.89倍。在相同處理?xiàng)l件下，GFP-S1w的熒光強(qiáng)度(熒光強(qiáng)度/菌濃600) 是GFP的16.22倍。SDS-PAGE分析也表明融合SAPs后條帶變粗，且蛋白分子量也發(fā)生一定變化，說明N端融合S1w后，酶/蛋白表達(dá)量顯著提高。

2.4 S1vw對(duì)不同酶蛋白純化效率的影響

野生型PGL、LOX及GFP不能直接用鎳柱親和層析進(jìn)行純化，由于野生型表達(dá)過程中蛋白含量較低，往往需要進(jìn)行一步硫酸銨或乙醇富集的工序，導(dǎo)致整個(gè)過程中蛋白質(zhì)回收率較低。表2詳細(xì)比較了野生型PGL、LOX及GFP與所對(duì)應(yīng)的S1w融合酶在不同純化條件下的回收率。結(jié)果顯示，在不經(jīng)過任何預(yù)處理的條件下，S1w的3種融合酶的回收率分別達(dá)到55.43%、34.22%和64.35%。而所對(duì)應(yīng)的野生型PGL、LOX及GFP，在相同條件下幾乎不能被有效純化，經(jīng)過硫酸銨和乙醇沉淀富集后用對(duì)應(yīng)的方法進(jìn)行純化[17-19]，回收率分別為20.45%、26.22%和36.54%。

此外，前期研究表明S11短肽也具有純化功能[12]，如表2所示，相同條件下PGL-S11與PGL-S1w的回收率相近，說明S1w保持了S11的純化功能。純化后蛋白電泳分析如圖3所示。且需要說明的是，前期研究已經(jīng)證明PGL和LOX的His-tag融合酶在相同條件下不能用鎳柱純化，GFP的His-tag融合酶在與GFP-S1w相同的純化條件下回收率僅有8%[12]。

2.5 S1vw對(duì)不同酶蛋白穩(wěn)定性的影響

為比較S1w對(duì)不同酶的穩(wěn)定性及催化活性的影響，測(cè)定純化后的野生型PGL、LOX及融合酶的比酶活及半衰期。結(jié)果顯示(圖4和圖5)，PGL-S1w在60 ℃下的半衰期由5.2 min提高至16.43 min，比酶活279.14 U/mg提高至758.9 U/mg。LOX-S1w在50 ℃下半衰期由9.4 min提高至29.78 min，比酶活由32.5 U/mg提高至82.3 U/mg。此外，與PGL-S1和PGL-S11相比[12]，S1w進(jìn)一步促進(jìn)了PGL的熱穩(wěn)定性和催化活性 (圖4)。

圖2 酶/蛋白及其對(duì)應(yīng)的SAPs融合酶表達(dá)量分析

表2 酶/蛋白純化收率表

圖3 酶/蛋白純化后的SDS-PAGE圖譜

圖4 PGL及其SAPs融合酶的半衰期與比酶活測(cè)定

2.6 S1vw在不同表達(dá)宿主中對(duì)融合酶表達(dá)量的影響

由于不同表達(dá)系統(tǒng)中異源蛋白的表達(dá)機(jī)制存在差異，故本研究以GFP為模式蛋白，比較S1w在不同宿主中(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和畢赤酵母)對(duì)GFP的表達(dá)量的影響。如圖6所示，在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中，融合S1w后熒光強(qiáng)度顯著提高，但在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，GFP和GFP-S1w的熒光強(qiáng)度相近，說明S1w在原核表達(dá)體系中對(duì)其融合酶的表達(dá)量有促進(jìn)作用，但對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)酶/蛋白異源表達(dá)的產(chǎn)量沒有明顯影響。

圖5 LOX及其SAPs融合酶的半衰期與比酶活測(cè)定

圖6 GFP和GFP-S1vw在不同表達(dá)宿主中的表達(dá)量

3 討論

酶的高表達(dá)、高穩(wěn)定性、高效純化工藝和循環(huán)利用技術(shù)是目前酶工程領(lǐng)域的主要研究方向。融合功能標(biāo)簽技術(shù)作為一種便捷、高效的酶蛋白改造策略也已經(jīng)在該領(lǐng)域取得一定實(shí)效成果[23]。本研究在SAPs的前期研究的基礎(chǔ)上[7, 12, 24]，提出一種可促進(jìn)在原核表達(dá)宿主中酶蛋白表達(dá)產(chǎn)量、提高融合酶穩(wěn)定性并可用于鎳柱純化的多功能標(biāo)簽S1w。分別將S1w以PT-linker融合在PGL、LOX和GFP的N端，在大腸桿菌中培養(yǎng)發(fā)酵，與對(duì)應(yīng)的野生型相比，粗酶活或熒光強(qiáng)度分別提高了3.1、1.89和16.22倍，且用鎳柱進(jìn)行親和層析純化達(dá)到了可觀的回收率。PGL和LOX的融合酶在對(duì)應(yīng)熱處理?xiàng)l件下的半衰期分別提高了2.16倍和3.2倍。將GFP-S1w在枯草芽孢桿菌及畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌中融合酶表達(dá)量提高明顯，但在畢赤酵母中表達(dá)量幾乎沒有改變。說明在原核表達(dá)體系中S1w可作為一種新型的促表達(dá)、穩(wěn)定化和純化的多功能標(biāo)簽。

S1類SAPs融合在酶蛋白N端時(shí)具有促進(jìn)融合酶表達(dá)和穩(wěn)定化的功能。為優(yōu)化S1類SAPs的促表達(dá)特性，在S1w中引入不帶電的天冬酰胺殘基和帶正電荷的精氨酸殘基，并插入正電荷的組氨酸以便用于鎳柱純化，結(jié)果表明，優(yōu)化之后的S1w促表達(dá)效果更加明顯，這很有可能是S1w整體呈現(xiàn)凈電荷為正的結(jié)果。但由于真核原核表達(dá)系統(tǒng)的差異，S1w在真核畢赤酵母中沒有促表達(dá)的功能，這也為后續(xù)SAPs的促表達(dá)研究提供一定的研究方向。

盡管S1w整體帶電情況發(fā)生改變，但其親疏水性交替分布的形式仍然與S1和S11類似，并且保持了S1類SAPs的穩(wěn)定化效果。SAPs內(nèi)的疏水氨基酸殘基對(duì)其融合酶形態(tài)至關(guān)重要，強(qiáng)疏水性的SAPs可直接導(dǎo)致活性包涵體的產(chǎn)生[24]。相比于S1和S11，S1w引入更多的疏水丙氨酸殘基，故其穩(wěn)定化功效進(jìn)一步提高。

生物活性酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用，酶的分離純化是工業(yè)酶成本計(jì)算的重點(diǎn)考量指標(biāo)之一。在所有酶的分離純化方法中[25]，親和層析是相對(duì)簡(jiǎn)單和節(jié)約成本的方法，其中最常用的就是組氨酸標(biāo)簽親和層析方法。在S1w中引入4個(gè)組氨酸，且均勻分布在S1w中，可提高組氨酸殘基與鎳柱的結(jié)合效率。此外，Slw融合酶的熱穩(wěn)定性較高，其在純化過程中活性損失較小，有利于提高目的蛋白的回收率[26]。

多功能標(biāo)簽的融合可以在融合單一蛋白或短肽的同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)酶/蛋白性質(zhì)的優(yōu)化，另一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)是可以減少由外來融合標(biāo)簽帶來的空間組織(結(jié)構(gòu)域)之間的相互影響，保持酶/蛋白原有催化或功能特性。因此，基于SAPs的多功能肽的開發(fā)將為酶或功能蛋白的改造研究提供新的技術(shù)手段和研究方向。

[1] Yu K, Liu CC, Kim BG, et al. Synthetic fusion protein design and applications. Biotechnol Adv, 2015, 33(1): 155–164.

[2] Kaur J, Kumar A, Kaur J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in: roadblocks and reinforcements. Int J Biol Macromol, 2018, 106: 803–822.

[3] Zhang Q, Wu XY, Jiang XK, et al. Trend of hybrid enzyme design in the big data era. Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1033–1045 (in Chinese). 張群, 吳秀蕓, 蔣緒愷, 等. 大數(shù)據(jù)時(shí)代雜合酶的設(shè)計(jì)及其新趨勢(shì). 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1033–1045.

[4] Takano K, Okamoto T, Okada J, et al. Stabilization by fusion to the C-terminus of hyperthermophileRNase HI: a possibility of protein stabilization tag. PLoS ONE, 2011, 6(1): e16226.

[5] Lu XY, Liu S, Zhang DX, et al. Enhanced thermal stability and specific activity oflipoxygenase by fusing with self-assembling amphipathic peptides. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(21): 9419–9427.

[6] Zhao Q, Xu WH, Xing L, et al. Recombinant production of medium-to large-sized peptides inusing a cleavable self-aggregating tag. Microb Cell Fact, 2016, 15: 136.

[7] Zhao WX, Liu S, Liu LM, et al. Analysis of the factors influencing the expression of enzymes fused with self-assembling amphipathic peptides. Food Ferment Ind, 2017, 43(12): 1–6 (in Chinese). 趙偉欣, 劉松, 劉立明, 等. 自組裝雙親短肽氨基酸組成及連接肽對(duì)其融合酶表達(dá)量的影響. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2017, 43(12): 1–6.

[8] Han RZ, Li JH, Shin HD, et al. Fusion of self-assembling amphipathic oligopeptides with cyclodextrin glycosyltransferase improves 2--D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid synthesis with soluble starch as the glycosyl donor. Appl Environ Microbiol, 2014, 80(15): 4717–4724.

[9] Liu Y, Cui WJ, Liu ZM, et al. Enhancement of thermo-stability and product tolerance ofnitrile hydratase by fusing with self-assembling peptide. J Biosci Bioeng, 2014, 118(3): 249–252.

[10] Yang HQ, Lu XY, Liu L, et al. Fusion of an oligopeptide to the N terminus of an alkaline α-amylase fromsimultaneously improves the enzyme’s catalytic efficiency, thermal stability, and resistance to oxidation. Appl Environ Microbiol, 2013, 79(9): 3049–3058.

[11] Liu S, Wang MX, Du GC, et al. Improvement of thermal stability of alkaline polygalacturonate lyase by fusing with self-assembling amphipathic peptides. Food Ferment Ind, 2015, 41(11): 1–6 (in Chinese).劉松, 汪明星, 堵國成, 等. 融合自組裝雙親短肽提高堿性果膠酶熱穩(wěn)定性. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(11): 1–6.

[12] Zhao WX, Liu LM, Du GC, et al. A multifunctional tag with the ability to benefit the expression, purification, thermostability and activity of recombinant proteins. J Biotechnol, 2018, 283: 1–10.

[13] Goodman DB, Church GM, Kosuri S. Causes and effects of N-Terminal codon bias in bacterial genes. Science, 2013, 342(6157): 475–479.

[14] Zhong C, Wei P, Zhang YHP. Enhancing functional expression of codon-optimized heterologous enzymes inBL21(DE3) by selective introduction of synonymous rare codons. Biotechnol Bioeng, 2017, 114(5): 1054–1064.

[15] Chen X. Study on the expression and fermentation optimization of L-asparaginase inWB600[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2015 (in Chinese).陳璇. L-天冬酰胺酶在WB600中的表達(dá)與發(fā)酵過程優(yōu)化研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2015.

[16] Ren CH, Zhang J, Du GC, et al. Enhancing thermal stability of glucose oxidase by fusing amphiphilic short peptide. Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1106–1116 (in Chinese). 任春慧, 張娟, 堵國成, 等. 基于融合雙親短肽提高葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1106–1116.

[17] Wang MX, Liu S, Liu L, et al. Fusions of amphipathic peptide to the alkaline polygalacturonate lyase fromsp. WSHB04-02 improves the production. J Food Sci Biotechnol, 2016, 35(5): 504–509 (in Chinese).汪明星, 劉松, 劉龍, 等. 融合短肽促進(jìn)堿性果膠酶的高效表達(dá). 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 35(5): 504–509.

[18] Qiu FF. Study on the high-level expression and thermal stability oflipoxygenase[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2017 (in Chinese).邱芳芳. 重組脂肪氧合酶的高效表達(dá)和熱穩(wěn)定性研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2017.

[19] Lu XY, Zhang J, Liu S, et al. Overproduction, purification, and characterization of extracellular lipoxygenase ofin. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(13): 5793-5800.

[20] O'Fágáin C. Enzyme stabilization-recent experimental progress. Enzyme Microb Technol, 2003, 33(2/3): 137–149.

[21] Charneski CA, Hurst LD. Positively charged residues are the major determinants of ribosomal velocity. PLoS Biol, 2013, 11(3): e1001508.

[22] Mei YZ, Chen YR, Zhai RY, et al. Cloning, purification and biochemical properties of a thermostable pectinase fromM29. J Mol Catal B: Enzymat, 2013, 94: 77–81.

[23] Kosobokova EN, Skrypnik KA, Kosorukov VS. Overview of fusion tags for recombinant proteins. Biochemistry (Moscow), 2016, 81(3): 187–200.

[24] Lin ZL, Zhou BH, Wu W, et al. Self-assembling amphipathic alpha-helical peptides induce the formation of active protein aggregates. Faraday Dis, 2013, 166: 243–256.

[25] Becker K, Van Alstine J, Bülow L. Multipurpose peptide tags for protein isolation. J Chromatogr A, 2008, 1202(1): 40–46.

[26] Farchaus JW, Ribot WJ, Jendrek S, et al. Fermentation, purification, and characterization of protective antigen from a recombinant, avirulent strain of. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(3): 982–991.

Development of a purification tag to produce thermostable fused protein

Weixin Zhao, Song Liu, Liming Liu, Jian Chen, and Guocheng Du

School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Self-assembling amphipathic peptides (SAPs) have alternating hydrophilic and hydrophobic residues and can affect the thermal stabilities and catalytic properties of the fused enzymes. In this study, a novel multifunctional tag, S1w (HNANARARHNANARARHNANARARHNARARAR) was developed to modify fused enzymes. After fusing S1w at the enzymes/proteins N-terminus through a PT-linker, the crude enzymatic activities of polygalacturonate lyase and lipoxygenase were enhanced 3.1- and 1.89-fold, respectively, compared to the wild-type proteins. The relative fluorescence intensity of the green fluorescent protein was enhanced 16.22-fold. All the three S1w fusions could be purified by nickel column with high purities and acceptable recovery rates. Moreover, S1w also induced the thermostabilities enhancement of the fusions, with polygalacturonate lyase and lipoxygenase fusions exhibiting 2.16- and 3.2-fold increase compared with the corresponding wild-type, respectively. In addition, S1w could enhance the production yield of green fluorescent protein inandwhile the production of GFP and its S1w fusion changed slightly in. These results indicated that S1w could be used as a multifunctional tag to benefit the production, thermal stability and purification of the fusion protein in prokaryotic expression system.

self-assembling amphipathic peptides, fusion enzymes,production yield, thermal stability, purification, expression host

10.13345/j.cjb.180363

September 9, 2018;

November 5, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31401638).

Song Liu. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: liusong@jiangnan.edu.cn

Liming Liu. Tel/Fax: +86-510-85197875; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 31401638) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)