東北褐環(huán)乳牛肝菌多糖提取及抗氧化活性研究

柴軍紅，何婷婷，于薇

(牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012)

褐環(huán)乳牛肝菌主要分布于中國(guó)的東北、西南的松林或混交林地上，國(guó)外日本、歐洲及北美也有分布，是口感不錯(cuò)的食用野生菌[1-2]。褐環(huán)乳牛肝菌富含多種氨基酸，維生素B族，粗纖維，多糖等[3-4]。其香氣成分中含松茸醇，異松茸醇，桂皮酸甲酯等組成其主要的風(fēng)味成分[3]。此外，還含有多酚、黃酮及皂苷類化合物[5]。食用菌多糖具有安全性高、功能性強(qiáng)的特點(diǎn)，具備顯著免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化等活性是食用菌研究熱點(diǎn)之一[6]。近年來(lái)褐環(huán)乳牛肝菌主要圍繞生境、共生、培育及發(fā)酵生產(chǎn)等做了大量工作，諸如：?jiǎn)T子晶等[7]、尹大川等[8-9]等研究松根際土壤關(guān)系及共生；李敏等[10]研究了發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)化的等。此外也有一些分子方面研究，對(duì)于清除自由基研究，主要有劉剛，劉品華團(tuán)隊(duì)做了一些比較研究[11-12]。

人體內(nèi)自由基以氧自由基為主，多數(shù)自由基可以破壞核酸及染色體、干擾細(xì)胞代謝、結(jié)合破壞蛋白質(zhì)和酶體系，從而加速機(jī)體的衰老[13]，可直接或間接引起慢性疾病及衰老效應(yīng)[14]，所以補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)具有好的臨床及保健價(jià)值。褐環(huán)乳牛肝菌中含有多肽類、多糖類等，本文以黑龍江地區(qū)產(chǎn)的褐環(huán)乳牛肝菌為對(duì)象，希望為其開(kāi)發(fā)提供一些理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

褐環(huán)乳牛肝菌：采自牡丹江地區(qū)，經(jīng)過(guò)牡丹江師范學(xué)院曲秀春教授鑒定為褐環(huán)乳牛肝菌。

1.2 主要試劑

R-10纖維素酶，Y-23果膠酶(BR，美國(guó)Sigma公司)，DPPH(優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Sigma公司)，鄰苯三酚(AR,上海展云化工有限公司)，七水硫酸亞鐵(AR，天津博迪化工股份有限公司)，無(wú)水乙醇(AR，天津進(jìn)豐化工有限公司)，食用酒精(95%，本地酒廠)，1,10-菲羅啉 (AR，瓦里西化工)，L-抗壞血酸(AR,上海埃彼化學(xué)試劑有限公司)，30%雙氧水、鹽酸(AR，哈爾濱試劑廠)等。

1.3 主要儀器

JJ-2型組織搗碎機(jī)勻漿機(jī)(武漢世紀(jì)超杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；SL-2010N超聲波萃取裝置(南京順流設(shè)備有限公司)；T6紫外可見(jiàn)分光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；BSA224S-CW電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；LGJ-18S冷凍真空干燥機(jī)(鄭州鳴一儀器設(shè)備有限公司)；PB-10酸度計(jì)(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 多糖提取。取1000g褐環(huán)乳牛肝菌用組織搗碎機(jī)破碎，以純水為提取劑，依據(jù)每100g固體加入1%果膠酶、2%纖維素酶，控溫37℃，pH在6.5下酶促處理2h；微波滅活；以固液比1∶10，功率600W，超聲波提取60min，提取2次[14]，合并濾液，濃縮至原體積1/10，sevage法除去蛋白，-70℃預(yù)凍8～12h，冷凍干燥備用。

1.4.2 多糖抗氧化研究。樣品液制備：精確稱取1.000g多糖的，配制成10mg/mL的提取物溶液作為母液。用母液分別配制2.0 mg/mL 、1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL的溶液[15]。

維生素C溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.2.1 超氧自由基清除能力測(cè)定：依據(jù)文獻(xiàn)方法[16-17]采用鄰苯三酚自氧化測(cè)定超氧自由基清除能力，總時(shí)間控制在3.5min內(nèi)，并依據(jù)以下公式計(jì)算。

清除率(%)=[(C0-C1)/C0]×100

C0(自氧化)：自氧化時(shí)吸光度隨時(shí)間變化

C1(樣品，維生素C)：加入樣品液后吸光度隨時(shí)間變化

1.4.2.2 羥基自由基清除能力測(cè)定：依據(jù)文獻(xiàn)[15,17]，方法略有改變，在510nm，采用菲羅啉- FeSO4- H2O2體系研究羥基自由基清除能力，并依據(jù)以下公式計(jì)算。

清除率(%)=[1-(Q1-Q2)]/[Q3-Q2]×100

Q1：樣品(維生素C)+鄰二氮菲- FeSO4- H2O2體系溶液的吸光度；

Q2：H2O2溶液+空白樣品體系溶液的吸光度；

Q3：不加H2O2和樣品(維生素C)的體系溶液的吸光度。

1.4.2.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定：依據(jù)文獻(xiàn)方法[18-19]，略有改動(dòng)，在520 nm下，暗條件反應(yīng)30min，并依據(jù)以下公式計(jì)算。

清除率(%)=[1-(D1-D2)/D0]×100

D0：DPPH和95%乙醇的吸光度

D1：DPPH和待測(cè)樣品(維生素C)的吸光度

D2：待測(cè)樣品(維生素C)95%乙醇的吸光度

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖超氧自由基的清除作用

圖1 多糖對(duì)超氧自由基的清除作用

依據(jù)圖1結(jié)果，濃度在0.2～0.6mg/mL清除率變化較平穩(wěn),并且隨著濃度升高變大，顯示濃度-清除率具有相關(guān)性，0.8mg/mL清除率可達(dá)48%以上，顯示一定的清除能力。

2.2 多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

圖2 多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

依據(jù)圖2結(jié)果，當(dāng)濃度0.2～0.6mg/mL清除率變化較為平緩，0.8mg/mL以上出現(xiàn)較大變化，最終達(dá)到62%以上，顯示較好清除率效果，由于羥基自由基與人體衰老有一定聯(lián)系，所以多糖具有一定潛在抗衰老活性[20]。

2.3 多糖對(duì)超氧自由基的清除作用

圖3 色素對(duì)DPPH自由基的清除作用

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度區(qū)間清除率上升較為平緩，這與文獻(xiàn)[11-12]較為吻合，在濃度在1mg/mL時(shí)就達(dá)到28%以上，體現(xiàn)出一定抗氧化效果。

2.4 多糖紅外測(cè)定結(jié)果

圖4多糖紅外光譜

依據(jù)圖4其3349.42cm-1附近的強(qiáng)吸收峰為O-H或N-H伸縮振動(dòng)峰；在2924.04cm-1處的尖峰是C-H(-CH2)伸縮振動(dòng)峰；其1079.56cm-1、1026 cm-1、548.42cm-1為吡喃糖特征吸收之一[15,21]，在1652.97cm-1處的強(qiáng)尖峰是C=O(-CHO)的伸縮振動(dòng)峰，表明此多糖為吡喃糖；578.42cm-1的弱小尖峰是β-吡喃環(huán)彎曲振動(dòng)峰，通過(guò)以上結(jié)果說(shuō)明多糖為β-型吡喃多糖。

3 結(jié)論

在樣品測(cè)定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的提升多糖對(duì)超氧自由基、羥基自由基、DPPH自由基的清除能力也逐漸增加。結(jié)果表明：其多糖對(duì)羥基自由基(·OH)的清除率為62.19%，顯示出具有抗疲勞應(yīng)用前景；多糖對(duì)超氧離子自由基(·O2-)的清除率最高為48.30%；其紅外表征顯示多糖為β-型吡喃多糖，所以多糖具有一定開(kāi)發(fā)潛力及價(jià)值。