基于MiSeq技術的枯草期放牧蒙古羊瘤胃細菌多樣性分析

范文斌，李長青，高仙靈，張金然，劉永斌

(1.呼和浩特職業(yè)學院 生物化學工程學院，內蒙古 呼和浩特 010051；2.內蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內蒙古 呼和浩特 010031)

蒙古羊是我國優(yōu)良的綿羊品種，主要分布在我國北方蒙古高原常年進行放牧的草原地區(qū)。蒙古羊具有抗病能力強、耐寒冷氣候、耐粗飼等特點，同時擁有較好的產(chǎn)肉和產(chǎn)皮毛性能。從古至今，牧民主要通過放牧的手段來飼養(yǎng)蒙古羊，它們是草原牧民賴以生存的生活保障和經(jīng)濟發(fā)展的主要物質基礎。在飼養(yǎng)蒙古羊的北方草原地區(qū)，冬春季節(jié)草原的枯草期長達7～8個月，研究表明，枯草期草原的牧草產(chǎn)量下降，牧草的蛋白質含量下降，粗纖維的含量增加[1]，在該時期僅僅通過放牧，蒙古羊攝取的營養(yǎng)已經(jīng)不能滿足其自身的需要[2]，最終導致牧民的收益降低。因此，在枯草期對蒙古羊進行補飼，以補充冬春季節(jié)枯草期蒙古羊的營養(yǎng)攝入量，是提高蒙古羊養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的可行方法[3-4]。

一般情況下，蒙古羊依靠采食天然牧草來維持生存和繁殖，但到了冬春季節(jié)的枯草期，牧草逐漸枯黃，品質顯著下降。在這種環(huán)境脅迫作用下，蒙古羊對牧草的利用反而變得更加高效，主要是由于蒙古羊體內的微生物種群結構在自然環(huán)境的長期選擇下，具有更合理的配置，從而對飼料完成了更加高效的消化、吸收與利用。瘤胃細菌數(shù)量增多和種群結構調整，均可以顯著改善蒙古羊的瘤胃內環(huán)境，提高其對劣質牧草的消化率，從而提高蒙古羊的日增體質量[5]。在冬季枯草期，牧草中的纖維素含量較高，因此，發(fā)揮微生物的協(xié)同作用來增加綿羊對牧草的消化率，可能是目前提高蒙古羊對牧草利用率低的有效途徑之一。因此，本研究通過對枯草期(1月中旬)放牧蒙古羊的瘤胃微生物菌群DNA進行高通量(MiSeq)測序，明確枯草期蒙古羊瘤胃微生物菌群的構成情況，以及枯草期牧草對蒙古羊瘤胃生理功能的影響和瘤胃消化的限制性因素，以期為研究蒙古羊瘤胃細菌的調控機制和探索科學補飼方法奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

在枯草期(1月中旬)，隨機選取錫林郭勒盟蘇尼特左旗草原上終年放牧(不補飼)的體況良好、體質量(50 kg)接近的6只蒙古羊(3～4歲)作為供試羊只。出牧前用真空瘤胃液收集裝置通過口腔分別抽取6只供試蒙古羊瘤胃液各約50 mL，用孔徑0.15 mm的4層滅菌紗布進行過濾，分裝于5 mL離心管中，迅速置于-80 ℃冰箱中保存，用于瘤胃細菌菌群DNA的提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用十二烷基硫酸鈉-十六烷基三甲基溴化銨(SDS-CTAB)方法提取細菌樣本基因組DNA[2]。取2 μL的DNA樣品，1%瓊脂糖電泳檢測。DNA溶液于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 16S rDNA擴增及MiSeq測序 細菌基因組文庫構建及MiSeq測序由上海美吉生物公司完成。以總DNA為模板，對細菌16S rDNA的V3—V4區(qū)進行PCR擴增，建立DNA文庫，所采用的細菌通用引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfu DNA Polymerase，PCR儀為ABI GeneAmp?9700型。將檢測合格的DNA片段經(jīng)電泳后，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收，并進行Tris-HCl洗脫，然后經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步檢測的結果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量，然后按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合，采用Illumina的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構建Illumina測序文庫，合格的文庫采用Illumina MiSeq進行2×300 bp的雙端測序。

1.2.3 基因序列的生物信息學分析 原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)質量控制后，舍棄低質量序列(Read尾部堿基質量小于20，質控后的Read小于50 bp)，獲得的高質量序列使用UPARSE version 7.1軟件(http://drive5.com/uparse/)進行OTU聚類，以16S rDNA序列97%的相似度作為OTU的劃分標準。獲得的OTU與RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/)進行比對，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個分類水平(門、綱、目、科、屬、種)統(tǒng)計每個樣品的群落組成。用Mothur version v.1.30.1指數(shù)分析軟件完成Alpha多樣性分析，包括豐富度指數(shù)(Chao、Ace)和多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)[6-8]。

2 結果與分析

2.1 蒙古羊瘤胃細菌OTU聚類和Alpha多樣性分析

對枯草期放牧蒙古羊的瘤胃細菌進行OTU聚類和Alpha多樣性計算，共獲得103 162條高質量的16S rDNA序列，平均每個樣品17 193.67條，平均長度為442.33 bp。序列經(jīng)拼接優(yōu)化后，根據(jù)97%的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，共獲得2 774個OTU，由表1可知，平均每個樣品OTU為462.30，Chao指數(shù)為559.00，Ace指數(shù)為546.00,Shannon指數(shù)為3.11，Simpson指數(shù)為0.22。

表1 枯草期放牧蒙古羊瘤胃細菌OTU聚類和Alpha多樣性指數(shù)

2.2 蒙古羊瘤胃細菌菌群結構分析

對蒙古羊瘤胃細菌共13個門、24個綱、30個目、59個科、85個屬進行鑒定，由表2可知，在門水平上，厚壁菌門(Firmicutes，58.59%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，18.18%)是放牧綿羊瘤胃中占主導地位的細菌，而軟壁菌門(Tenericutes，5.99%)、變形菌門(Proteobacteria，5.62%)相對含量也較高。瘤胃菌科(Ruminococcaceae，15.43%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae，14.86%)和克里斯蒂娜科(Christensenellaceae，11.90%)在科的水平上為絕對的優(yōu)勢菌。在屬水平上，除了未分類和RC9外，普雷沃氏菌屬(Prevotella，2.89%)和Candidatussaccharimonas(2.89%)是瘤胃中占主導地位的細菌。這些微生物在枯草期蒙古羊瘤胃消化牧草的過程中均起著重要的作用。

3 結論與討論

在北方牧區(qū)枯草期放牧蒙古羊瘤胃細菌中，厚壁菌門在門水平上，瘤胃菌科和毛螺菌科在科水平上為絕對的優(yōu)勢菌，表現(xiàn)出典型的纖維消化菌群特征，因此，在冬春季為這2種菌科的細菌提供營養(yǎng)，將有效改善蒙古羊瘤胃的發(fā)酵功能，提高其對牧草的消化率。

表2 不同分類水平相對豐度較高的瘤胃細菌Tab.2 Rumen bacteria with higher relative abundance at different classification levels

蒙古羊在長期的自然進化過程中形成了獨特的瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)，其內棲息著多種多樣的微生物，與宿主之間形成了一種相互制約、相互依賴的復雜動態(tài)平衡，在對營養(yǎng)物質消化吸收中起著舉足輕重的作用。特別是在冬季枯草期，牧草的纖維素含量較高，發(fā)揮蒙古羊瘤胃微生物的協(xié)同作用來增加牧草的消化率，是提高牧草利用率的有效手段，可以提高放牧家畜補飼的效果并降低養(yǎng)殖成本。因此，了解枯草期放牧蒙古羊瘤胃微生物的情況是提高蒙古羊放牧養(yǎng)殖效益的第一步。

本研究通過對蒙古羊瘤胃細菌種群DNA進行MiSeq測序，明確了蒙古羊在枯草季節(jié)瘤胃微生物菌群構成情況。研究結果表明，在門水平上，放牧蒙古羊瘤胃細菌中厚壁菌門(58.59%)和擬桿菌門(18.18%)為放牧羊瘤胃中的優(yōu)勢細菌種群，其中厚壁菌門為絕對的優(yōu)勢菌。這種菌群組成類似于其他品種羊的瘤胃微生物結構，孫國雷[9]的研究表明，濟南動物園喜馬拉雅塔爾羊瘤胃細菌相對豐度最高的為厚壁菌門(66.11%)、擬桿菌門(25.91%)，歐洲盤羊瘤胃細菌相對豐度最高的為厚壁菌門(57.17%)、擬桿菌門(33.67%)、巖羊瘤胃細菌相對豐度最高的為厚壁菌門(57.22%)、擬桿菌門(33.48%)，與本研究的結果相近，它們均表現(xiàn)出典型的纖維消化菌群特征，因此，這2個種群瘤胃細菌的變化將影響羊瘤胃的消化能力。但在陳蕓等[10]研究中，川中黑山羊瘤胃細菌相對豐度最高的為擬桿菌門(40.87%)和厚壁菌門(27.19%)，在曾燕[11]研究中，四川雅安市蒙古羊瘤胃相對豐度最高的為擬桿菌門(67.00%)和厚壁菌門(23.00%)，本研究中，放牧蒙古羊瘤胃相對豐度最高的為厚壁菌門(58.59%)和擬桿菌門(18.18%)，與前者存在較大的差異。這個結果可能與地區(qū)差異引起的飼喂飼料不同有關，此外，不同品種羊瘤胃內的優(yōu)勢細菌相對豐度也存在一定的差異。蒙古羊常年放牧于草原，大多數(shù)時間采食的是富含纖維的牧草，因此瘤胃內細菌以分解纖維的厚壁菌門為主，厚壁菌門中瘤胃球菌屬、丁酸弧菌屬和假丁酸弧菌屬等纖維降解菌促進纖維物質的消化吸收[12]。而生產(chǎn)中舍飼羊一般以飼喂富含淀粉的精料居多，因此以分解淀粉、可溶性碳水化合物的擬桿菌門占優(yōu)勢。擬桿菌門能分解飼料中的碳水化合物和蛋白質等物質，并協(xié)助宿主利用飼料中其本身不能消化的多糖成分，促進飼料中營養(yǎng)物質的消化吸收，從而提高營養(yǎng)物質的利用率[13]。

在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，放牧蒙古羊瘤胃細菌的60.00%以上為不能培養(yǎng)或者不能命名的種類，明確鑒定的菌屬主要包括普雷沃氏菌屬(2.89%)、Candidatussaccharimonas(2.89%)和丁酸弧菌屬(1.44%)。BEKELE等[14]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊瘤胃中大部分普雷沃氏菌(87.80%)的序列與已知普氏菌序列的相似度低于97.00%，表明不可培養(yǎng)的普氏菌數(shù)量遠超過已知的普氏菌，其特定的生理功能也有待于進一步探索[15]。川中黑山羊瘤胃相對豐度最高的菌屬為普雷沃氏菌屬(25.53%)，其次是琥珀酸弧菌屬(7.56%)[10]，四川雅安市蒙古羊瘤胃相對豐度最高的普雷沃氏菌屬所占比例為53.00%[11]，均與本研究有較大的差異。SINGH等[16]研究表明，水牛瘤胃中普雷沃氏菌在纖維飼料精粗比為0∶100的營養(yǎng)條件下數(shù)量最高，說明瘤胃普雷沃氏菌在反芻動物瘤胃中具有非常重要的作用。另外，品種差異也會導致瘤胃微生物的組成發(fā)生變化，有研究發(fā)現(xiàn)，不同品種反芻動物瘤胃內微生物多樣性差別較大[17]。但瘤胃內微生物對反芻動物的影響是不容忽視的。