植物脂肪氧化酶的特性與功能

謝鴻光 ，許惠濱 ，潘麗燕 ，連 玲 ，江敏榕 ，魏林艷 ，張建福

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建福州350018；2.農(nóng)業(yè)部華南雜交水稻種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福州（國(guó)家）水稻改良分中心/福建省作物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室/福建省水稻分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華南研究基地/水稻國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003）

脂肪氧化酶（LOXs，亞油酸：氧化還原酶）含有非血紅素鐵或錳，是一類專一催化多元不飽和脂肪酸（如亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸）加氧反應(yīng)的雙加氧酶，其催化的多元不飽和脂肪酸含有順，順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)，生成的多元不飽和脂肪酸的氫過(guò)氧化物含有共軛雙鍵［1］。LOXs大量存在于動(dòng)物、植物和微生物中［2］，在植物中，它主要催化含有18個(gè)碳的亞油酸 （Linoleic acid）和亞麻酸（Linolenic acid）的反應(yīng)［3］；在動(dòng)物中，它則是以20個(gè)碳的花生四烯酸 （Arachidonic acid）為底物。通常把由LOXs及其后續(xù)一系列反應(yīng)催化多元不飽和脂肪酸（PUFA）的代謝過(guò)程稱為L(zhǎng)OX途徑（Lipoxygenase pathway）［4］，植物體內(nèi) LOX途徑的主要過(guò)程如圖1所示。

圖1 植物體內(nèi)LOX途徑

目前的研究發(fā)現(xiàn)在大豆、花生、擬南芥、黃瓜、大麥、豌豆、番茄和水稻等植物中均存在LOXs，其表達(dá)受各種因素影響，如生長(zhǎng)階段、激素、非生物脅迫和真菌感染等［5］。此外，從不同的植物分離出的LOXs基因具有不同的組織特異性表達(dá)，不同的植物種類及其不同的生長(zhǎng)階段LOXs的活性也隨之變化［3］。亞細(xì)胞結(jié)果表明，植物中的LOXs主要分布于脂體、微粒體、葉綠體、液泡、質(zhì)膜和胞漿中，同時(shí)在脂體膜和質(zhì)膜上也有發(fā)現(xiàn)，它們主要以跨膜蛋白的形式存在［6，7］。在植物中，LOXs催化底物產(chǎn)生手性與位置專一性不同的氫過(guò)氧化基，因此可將其分為3種類型［7］：第1類是催化底物生成9S-氫過(guò)氧化物（9-HPOD）的9-氫過(guò)氧化亞油酸（9-LOX），如番茄果實(shí)和馬鈴薯塊莖中的LOX、豌豆種子以及水稻種胚中的LOX3；第2類是催化底物生成13S-氫過(guò)氧化物（13-HPOD）的13-氫過(guò)氧化亞油酸（13-LOX），如大豆種子的LOX1和豌豆種子的LOX2；第3類是9/13-LOX，它是一種非傳統(tǒng)的LOX，生成等量的9-HPOD和13-HPOD［8］，如大豆種子中的LOX2和LOX3。

近年來(lái)，伴隨越來(lái)越多研究小組的加入，人們對(duì)植物L(fēng)OXs及其反應(yīng)產(chǎn)物氧化脂（oxylipins）的了解越來(lái)越深入。此外，克隆了一系列植物L(fēng)OXs基因序列，為進(jìn)一步揭示它們的系統(tǒng)發(fā)育并闡明LOXs基因序列與結(jié)構(gòu)、區(qū)域選擇性和活性關(guān)系提供了可能。綜述了有關(guān)植物L(fēng)OXs的生理學(xué)作用。

1 調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育

研究表明，在大豆生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，其體內(nèi)的LOXs含量不斷變化著，當(dāng)其組織處于快速生長(zhǎng)階段時(shí)，其體內(nèi)的LOXs活性很高，因此，研究者認(rèn)為在大豆生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，LOXs發(fā)揮重要的調(diào)控作用。此外，證明LOXs調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育的證據(jù)還來(lái)自Porta等人［9］，他們?cè)谔幱谏L(zhǎng)發(fā)育的菜豆根瘤中檢測(cè)到LOXs活性，并驗(yàn)證到其相應(yīng)的mRNA的表達(dá)，當(dāng)根瘤生長(zhǎng)停止的時(shí)候，LOXs及其相應(yīng)的mRNA的含量都是不斷地下降，直到消失為止，因此，Porta 等人推測(cè)菜豆根瘤的發(fā)育可能受LOXs的調(diào)控。

馬鈴薯LOX1基因是一個(gè)具有塊莖專一性表達(dá)的基因，其編碼產(chǎn)物具有9-LOX活性，原位雜交結(jié)果證實(shí)其主要在發(fā)育的塊莖中表達(dá)。2001年，Kolomiets等［10］通過(guò)研究轉(zhuǎn)反義LOX1基因的馬鈴薯植株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其塊莖的產(chǎn)量明顯下降，而且形狀畸形，表明LOX1參與調(diào)控塊莖的發(fā)育和生長(zhǎng)，并可能與LOXs的反應(yīng)產(chǎn)物羥脂（oxylipin）有關(guān)。當(dāng)然，也不排除LOXs調(diào)控種子萌發(fā)和根瘤發(fā)育的可能性［3］。

2 調(diào)節(jié)植物組織衰老

在植物中，脂質(zhì)過(guò)氧化及其產(chǎn)生的自由基導(dǎo)致其膜降解進(jìn)而引起組織衰老，而脂肪氧化酶及其催化產(chǎn)生的氫過(guò)氧化物可能直接參與了以上反應(yīng)［11］。LOXs還參與啟動(dòng)了組織的膜脂過(guò)氧化作用［12］，在促進(jìn)酶的失活反應(yīng)的同時(shí)，還抑制葉綠體的光化學(xué)活性，最終加速細(xì)胞膜的降解［13］；其催化產(chǎn)生的自由基加劇細(xì)胞組分降解，促進(jìn)組織衰老。

研究發(fā)現(xiàn)，LOXs與植物果實(shí)成熟和衰老密切相關(guān)，但對(duì)其生理作用機(jī)理的研究還不是很透徹。我們知道乙烯（C2H4）調(diào)節(jié)果實(shí)后熟進(jìn)程，人為調(diào)控其合成可實(shí)現(xiàn)此目的。而C2H4的合成需要有自由基及過(guò)氧化物的參與，LOXs催化所產(chǎn)生的超氧自由基正好可以參與該反應(yīng)［14］。另外，茉莉酸（JA）和脫落酸（ABA）也是促進(jìn)植物組織衰老的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，它們的合成同樣需要有LOXs的參與［3，15］。番茄果實(shí)成熟伴隨著LOXs活性的增強(qiáng)，人為施加LOXs能夠使果實(shí)組織電導(dǎo)率增加，從而促進(jìn)果實(shí)的成熟與衰老；研究人員還發(fā)現(xiàn)外源施加乙烯促使番茄果實(shí) LOXs活性增強(qiáng)［16］。獼猴桃的果實(shí)采摘后初始階段，伴隨著LOXs活性不斷增強(qiáng)，啟動(dòng)了膜脂的過(guò)氧化反應(yīng)，不斷消耗底物亞麻酸和亞油酸，且不斷釋放出游離的脂肪酸，最終引起亞麻酸和亞油酸的積累［17］。此外，在蘋果儲(chǔ)存過(guò)程中，LOXs活性與乙烯合成量呈正相關(guān)，它不僅啟動(dòng)果實(shí)成熟反應(yīng)，還誘導(dǎo)合成乙烯，加速果實(shí)的成熟與衰老［7］。

3 防御病蟲(chóng)害

前人的研究表明，LOX途徑與植物對(duì)病蟲(chóng)害的防衛(wèi)反應(yīng)息息相關(guān)。其產(chǎn)生的茉莉酸（JA）是參與植物轉(zhuǎn)導(dǎo)防御反應(yīng)的重要的信號(hào)因子；此外，生成的多種脂肪酸的氧化物，包括二乙烯乙醚類（divinylethers）和醛類（aldehydes），都具有抗病菌和蟲(chóng)害的活性［18-20］。

當(dāng)植物受到害蟲(chóng)與病原菌侵染時(shí)，引起其體內(nèi)的LOXs活性及其代謝產(chǎn)物的含量不斷地提高，包括脂氫過(guò)氧化物、氧化自由基和醛、酮等揮發(fā)性物質(zhì)等，它們都可以實(shí)現(xiàn)抑制病蟲(chóng)生長(zhǎng)以及抵御病原菌侵染的目的，具體表現(xiàn)為在抗病植株體內(nèi)LOXs的活性比敏感植株高很多。當(dāng)大豆葉片受傷后，其體內(nèi)的LOXs酶活性急劇增強(qiáng)［21］；后面的研究又證實(shí)水稻稻瘟病菌［22］以及煙草 P.parasitica［23］都可以誘導(dǎo)LOXs的表達(dá)，這說(shuō)明許多植物中LOXs的表達(dá)均受蟲(chóng)害和病原微生物的誘導(dǎo)。以上現(xiàn)象有兩種可能的解釋：① LOX途徑產(chǎn)生的代謝物具有抗真菌活性，能夠抑制真菌的生長(zhǎng)；② 啟動(dòng)LOX途徑誘導(dǎo)植物過(guò)敏性反應(yīng)（Hypersensitive reaction，HR）。前人的研究表明，LOXs活性增高和HR反應(yīng)具有相關(guān)性，其可能原因是LOXs催化不飽和脂肪酸進(jìn)而生成的脂氫過(guò)氧化物很不穩(wěn)定，且極易通過(guò)均裂反應(yīng)而生成大量的活性氧自由基，參與細(xì)胞膜脂的過(guò)氧化，從而破壞質(zhì)膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死［24，25］。同時(shí)HR的進(jìn)行需要激活9-LOX和 13-LOX［26］，其中，9-LOX主要負(fù)責(zé)脂肪酸的過(guò)氧化，而13-LOX則負(fù)責(zé)JA的合成，這進(jìn)一步說(shuō)明HR的發(fā)生依賴于LOXs的存在。

4 作為儲(chǔ)藏蛋白

LOXs普遍存在于植物種子中，然而，尚未出現(xiàn)相關(guān)的研究表明其對(duì)種子發(fā)育發(fā)揮特定的功能。在非種子表達(dá)的植物中，LOXs可以以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)儲(chǔ)藏蛋白（vegetative storage protein, VSP）的形式存在，如大豆葉肉細(xì)胞液泡中營(yíng)養(yǎng)器官的儲(chǔ)藏蛋白就是LOXs。在大豆種子發(fā)育過(guò)程中，3種LOX的含量占全部可溶性蛋白的1%，到萌發(fā)的早期它們就完全消失。同時(shí)在大豆子葉中出現(xiàn)三種新的LOX同工酶，它們均不是位于脂體膜上，也不參與儲(chǔ)藏脂質(zhì)的降解。以上結(jié)果表明植物種子LOXs可能具有種子儲(chǔ)藏蛋白的功能［3］。

5 參與種子儲(chǔ)藏

在植物的生活史中，種子是重要的階段之一，且在植物繁衍中發(fā)揮著不可替代的作用。在儲(chǔ)藏過(guò)程中，通常隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，種子會(huì)不斷老化劣變，活力不斷下降。產(chǎn)生此現(xiàn)象最主要的一個(gè)原因是細(xì)胞膜完整性的喪失，而細(xì)胞膜完整性喪失的關(guān)鍵因素則是過(guò)氧化物、自由基以及膜脂過(guò)氧化代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和毒害作用，它們是引起植物組織衰老和種子劣變的主要原因［27］。脂體（lipid body，又稱油體，oil body）是一種由磷脂單分子層包裹的儲(chǔ)藏甘油三酯的球體結(jié)構(gòu)，也是儲(chǔ)藏脂類聚集的主要細(xì)胞器，而LOXs則是定位在脂體膜上催化儲(chǔ)藏脂類轉(zhuǎn)運(yùn)和降解的限速酶。

6 在食品加工中的應(yīng)用

LOXs普遍存在于各種食品原料中，一方面其催化的生化反應(yīng)可能影響食品加工品質(zhì)；另一方面，其代謝產(chǎn)物可能降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，主要是通過(guò)直接與食品中的有效成分（氨基酸和蛋白質(zhì)）結(jié)合，因此，研究人員建議在食品加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中應(yīng)盡可能降低LOXs含量與活性［28］。

大豆由于其富含營(yíng)養(yǎng)而備受青睞，而在大豆的加工過(guò)程中，LOXs通過(guò)分解不飽和脂肪酸產(chǎn)生小分子揮發(fā)性物質(zhì)醛、酮和醇等，這就是豆腥味產(chǎn)生的原因所在。為此，前人大量研究如何通過(guò)降低大豆LOXs活性來(lái)消除豆制品的豆腥味，最后發(fā)現(xiàn)，豆腥味的產(chǎn)生與大豆體內(nèi)LOXs的活性存在正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變介質(zhì)的pH值、加入醛水解酶、微波處理和有機(jī)溶劑萃取等均可降低豆腥味。但這些方法卻增加了豆制品的加工成本，還引起大豆蛋白水溶性下降。因此，應(yīng)該從根本上解決此問(wèn)題，即培育低LOXs含量的大豆品種。1999年，麻浩等［29］利用誘變技術(shù)培育了一個(gè)純合的LOX缺陷型大豆新品種。研究發(fā)現(xiàn)，蠶豆粉或大豆粉中的LOXs可以與面粉中的類胡蘿卜素發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)漂白面團(tuán)，因此，可以往面粉中添加些許的蠶豆粉或大豆粉，其中的LOXs不但可以漂白面粉，還能夠提高焙烤食品的質(zhì)量。LOXs還具有使食品發(fā)生顏色變化的作用，比如苜蓿加工飼料中的葉黃素及其它有色類胡蘿卜素的降解，冷凍和加工蔬菜中葉綠素的破壞，還有添加于食品中的色素的降解等［30］。而LOXs提高烘焙食品質(zhì)量的原理主要包括兩個(gè)方面：一、在面筋蛋白質(zhì)中形成二硫鍵-S-S，從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化并使帶電基團(tuán)轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)表面，改變面團(tuán)的流變性；二、氧化面筋蛋白，釋放結(jié)合的脂肪，防止脂肪的結(jié)合反應(yīng)，促進(jìn)游離脂肪數(shù)量增加，有效改進(jìn)面包的柔軟度［31］。

另外，LOXs還應(yīng)用于茶葉加工過(guò)程。人們?cè)诩t茶和烏龍茶的發(fā)酵過(guò)程中利用LOXs來(lái)催化亞麻酸和亞油酸的氧化分解，生成茶葉特有的香氣成分，包括已烯醇、已烯醛和正己醛等。

7 討論

脂質(zhì)過(guò)氧化是所有生物系統(tǒng)中常見(jiàn)的一種代謝反應(yīng)，出現(xiàn)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，調(diào)控生物和非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制。脂質(zhì)過(guò)氧化的初始階段可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)促使其發(fā)生，也可來(lái)自酶的催化作用。在植物中，這種反應(yīng)主要是由脂肪氧化酶催化的。LOXs亞型的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能的多樣性使植物能夠適當(dāng)?shù)仨憫?yīng)環(huán)境的挑戰(zhàn)。JA及其十八烷酸前體是第一個(gè)具有信使功能的氧化脂蛋白。越來(lái)越多的研究表明這些化合物在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫反應(yīng)中起“主開(kāi)關(guān)”作用。此外，其他的氧化脂蛋白作為公認(rèn)的信號(hào)分子也逐漸受到關(guān)注。

近幾年來(lái)，對(duì)LOX通路復(fù)雜性及其生理意義的了解顯著增加。對(duì)不同植物L(fēng)OXs的研究為揭示它們的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。反向遺傳學(xué)方法為脂肪氧化酶功能的研究提供了初步的見(jiàn)解。此外，氧化脂蛋白生物合成突變體的產(chǎn)生，以及編碼LOX途徑相關(guān)酶基因的持續(xù)過(guò)表達(dá)和失活，有望拓寬我們對(duì)脂肪氧化酶參與植物發(fā)育與逆境適應(yīng)的生理功能的認(rèn)識(shí)。