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    Gene Xpert-MTB/RIF檢測(cè)法在結(jié)核病診斷中的意義

    2019-04-22 03:26:06虞忻宋華峰馮彥軍葉志堅(jiān)
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2019年6期
    關(guān)鍵詞:抗酸利福平涂片

    虞忻 宋華峰 馮彥軍 葉志堅(jiān)

    蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院,蘇州市傳染病醫(yī)院,蘇州市第五人民醫(yī)院(江蘇蘇州215000)

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis,MTB)感染所引起的慢性傳染性疾病,是全球公共衛(wèi)生面臨的巨大威脅[1]。WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,全球MTB感染人數(shù)960萬(wàn),其中150萬(wàn)人最終死于結(jié)核病。根據(jù)WHO的2016年全球結(jié)核病年度報(bào)顯示[2],我國(guó)新發(fā)結(jié)核病例數(shù)位居全球第3位,也是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)及廣泛耐藥結(jié)核?。╔DR-TB)中,全球最高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。同時(shí)我國(guó)也是在PTB、TB合并AIDS及MDR-TB三種疾病的14個(gè)高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[3]。結(jié)核病很有可能因耐多藥甚至廣泛耐藥成為不治之癥,早發(fā)現(xiàn)、早診治成為有效控制結(jié)核病的關(guān)鍵。

    目前肺結(jié)核的診斷主要依靠痰涂片抗酸染色及痰結(jié)核培養(yǎng),痰涂片抗酸染色法陽(yáng)性率低、敏感性差[4],且有30%~60%的PTB患者無(wú)法根據(jù)細(xì)菌學(xué)確診[5],而痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)所需周期長(zhǎng),所以上述方法不能滿足早期診斷的需要甚至可能延誤診療,導(dǎo)致結(jié)核病播散,阻礙結(jié)核病的控制。隨著分子生物學(xué)發(fā)展,WHO重點(diǎn)推薦一種新型分子檢測(cè)方法GeneXpert-MTB/利福平(RIF)(簡(jiǎn)稱Xpert)。Xpert檢測(cè)方法是一種以半巢式實(shí)時(shí)定量熒光PCR為基礎(chǔ),以rpoB基因?yàn)榘谢?,自?dòng)提取DNA并擴(kuò)增rpoB基因中的192 bp片段,并檢測(cè)MTB及其對(duì)RIF是否耐藥。由于Gene Xpert-MTB/RIF檢測(cè)法生物安全性好,敏感度高,及檢測(cè)時(shí)間短,已逐步推廣并應(yīng)用于臨床[6-7]。本研究通過(guò)對(duì)比此技術(shù)與傳統(tǒng)痰檢方法,探討其在臨床診斷中的價(jià)值。

    1 資料與方法

    1.1 標(biāo)本來(lái)源收集蘇州市第五人民醫(yī)院2017年8月至2017年12月收治住院的肺結(jié)核患者209例,年齡13~81歲,其中男130例,女79例,平均年齡47.68歲。

    1.2 試劑及儀器BACTEC MGIT 960分枝桿菌分析系統(tǒng)、MGIL培養(yǎng)管;Xpert MTB/RIF kit;核酸快速提取儀Extractor 36;抗酸染色試劑、分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)管等。

    1.3 研究方法

    1.3.1 痰涂片檢查根據(jù)抗酸染色鏡檢結(jié)果進(jìn)行報(bào)告,操作過(guò)程是按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》的要求進(jìn)行。

    1.3.2 痰培養(yǎng)(1)通過(guò)連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度,來(lái)測(cè)定分枝桿菌的生長(zhǎng)情況。(2)在1~2 mL痰液加入50 mL離心管中,加入4%NaOH震蕩并混勻,靜置并離心后去上清,留沉淀。(3)在培養(yǎng)管中加入雜菌抑制劑(PANTA)和營(yíng)養(yǎng)添加劑(OADC)混合添加劑0.8 mL。(4)抽取0.5 mL樣本注入MGIT培養(yǎng)管中并將培養(yǎng)管放入BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。

    1.3.3 結(jié)核分枝桿菌改良羅氏及比例法藥敏實(shí)驗(yàn)(1)分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)管中設(shè)定異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素濃度。(2)制備及稀釋菌液。(3)用接種環(huán)沾取1滿環(huán)約為0.01 mL體積的不同稀釋倍數(shù)菌懸液,用劃線法均勻涂布于各培養(yǎng)基表面。(4)37℃培養(yǎng),至4周報(bào)告結(jié)果。

    1.3.4 XpertMTB/RIF核酸擴(kuò)增檢測(cè) (1)前處理管中放入1 mL痰液標(biāo)本,并加入液化液。(2)渦旋振蕩15~30 s后靜置15 min,取2 mL處理后樣品緩慢加入反應(yīng)盒。(3)將反應(yīng)盒放入檢測(cè)模塊中并自動(dòng)化檢測(cè)出結(jié)果。

    1.3.5 質(zhì)量控制本實(shí)驗(yàn)操作人員均參加并通過(guò)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心組織的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室藥敏測(cè)試及全國(guó)結(jié)核病分子診斷技術(shù)能力驗(yàn)證等培訓(xùn)及考試。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,進(jìn)行χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 XpertMTB/RIF對(duì)痰結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果分析209例肺結(jié)核患者中,痰涂片陽(yáng)性49例(23.4%),痰涂片弱陽(yáng)性5例(2.4%),痰涂片陰性155例(74.2%);痰培養(yǎng)陽(yáng)性87例(41.6%),痰培養(yǎng)陰性122例(58.4%);Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性86例(41.1%),Xpert MTB/RIF檢測(cè)弱陽(yáng)性9例(4.3%),陰性114例(54.6%)。Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于痰涂片,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);痰結(jié)核培養(yǎng)陽(yáng)性率也明顯高于痰涂片抗酸染色找抗酸桿菌陽(yáng)性率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率與痰培養(yǎng)陽(yáng)性率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。

    表1 202例痰標(biāo)本的3種檢測(cè)方法結(jié)果比較Tab.1 comparison of the results of three methods for the detection of 202 sputum specimens例(%)

    以痰結(jié)核培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn),Xpert MTB/RIF檢測(cè)痰涂片抗酸染色陽(yáng)性患者的MTB敏感度為95.0%、特異度為44.4%;檢測(cè)痰涂片陰性患者的結(jié)核分枝桿菌敏感度為58.1%、特異度為85.8%;全部患者的敏感度為75.9%,特異度為82.8%(表2)。

    2.2 Xpert MTB/RIF和傳統(tǒng)比例法檢測(cè)利福平耐藥的比較以傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn),Xpert MTB/RIF檢測(cè)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的利福平耐藥敏感度為50.0%,考慮可能與樣本量少有關(guān),特異度為100.0%;檢測(cè)痰涂片陰性患者利福平耐藥敏感度為70.0%,特異度為100%;全部患者Xpert MTB/RIF檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為66.7%,特異度為100.0%(表3)。在同時(shí)痰培養(yǎng)陽(yáng)性、Xpert MTB/RIF檢測(cè)也陽(yáng)性患者中,對(duì)Xpert MTB/RIF及傳統(tǒng)比例法檢測(cè)利福平耐藥做Kappa檢驗(yàn),結(jié)果一致性好(Kappa=0.926)。

    3 討論

    我國(guó)是全球結(jié)核病疫情最為嚴(yán)重的國(guó)家之一,結(jié)核病尤其是重癥結(jié)核、MDR-TB、XDR-TB的早期診治值得尤為關(guān)注[8]。目前,新型分子診斷技術(shù)在全球廣泛開(kāi)展,Xpert MTB/RIF以其簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高的特點(diǎn)收到高度關(guān)注。Xpert MTB/RIF檢測(cè)方法是同時(shí)采用6種分子信標(biāo)及檢測(cè)6種分子探針,選擇性覆蓋rpoB基因的81 bp核心區(qū),由此檢測(cè)MTB及是否對(duì)RIF耐藥;內(nèi)對(duì)照采用另1個(gè)球芽孢桿菌特異探針,以判斷DNA擴(kuò)增效率。幾乎所有的RIF敏感菌株在該區(qū)域具有相同的核酸序列,RIF耐藥菌株中95%以上均由rpoB基因變異所導(dǎo)致,因此rpoB基因能作為利福平相關(guān)基因,并具備測(cè)定RIF耐藥菌株的能力[9-10]。將樣品準(zhǔn)備、定量PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)集一身的Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù),作為世界上唯一一體化全自動(dòng)實(shí)時(shí)定量PCR體外診斷技術(shù),僅2 h便可以檢測(cè)出MTB及其RIF耐藥情況[11-12]。該檢測(cè)系統(tǒng)操作快捷簡(jiǎn)便,實(shí)驗(yàn)中基本不產(chǎn)生氣溶膠,減少了樣本中MTB生物危害的風(fēng)險(xiǎn)[13],而且試劑盒需獨(dú)立存放,減少了DNA的污染可能,這些特點(diǎn)均超越了傳統(tǒng)檢測(cè)方法,并能早期診斷RR-TB及MDR-TB,使全球MDR-TB檢出率提高3~8倍[14],受到WHO的高度推崇。

    表2 Xpert MTB/RIF檢測(cè)與痰培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果的比較Tab.2 comparison of the results of Xpert MTB/RIF and sputum culture 例(%)

    表3 Xpert MTB/RIF和傳統(tǒng)藥敏檢測(cè)利福平耐藥的比較Tab.3 comparison of rifampicin resistance by Xpert MTB/RIF and traditional drug sensitivit 例(%)

    本研究209例肺結(jié)核患者中,Xpert MTB/RIF檢測(cè)的陽(yáng)性率為41.1%,明顯高于痰涂片,而與傳統(tǒng)痰培養(yǎng)相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果一致。以痰培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn),Xpert檢測(cè)的敏感度高達(dá)75.9%、特異度高達(dá)82.8%,與現(xiàn)有的國(guó)際上Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)的研究結(jié)果相似[15]。檢測(cè)總特異度高,說(shuō)明Xpert對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢出假陽(yáng)性較低、準(zhǔn)確率很高[16-17]。其中在痰涂片陰性患者中,Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB敏感度較總敏感度偏低,可能和負(fù)荷菌量偏低有關(guān),但也高達(dá)58.1%,說(shuō)明Xpert能顯著提高菌陰患者的結(jié)核檢出率;檢測(cè)痰涂片陽(yáng)性患者中,獲得的特異度為44.4%,這4例假陽(yáng)性患者抗結(jié)核治療均有效,所以考慮雖然當(dāng)時(shí)不能符合臨床確診標(biāo)準(zhǔn),但考慮確實(shí)存在結(jié)核感染可臨床診斷肺結(jié)核。近幾年有報(bào)道表明,Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)在運(yùn)用于腸結(jié)核等肺外結(jié)核患者上,敏感度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于涂片抗酸染色法,與快速結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法基本相同,特異度高[18]。Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB的高敏感度極大提高肺結(jié)核檢出率,尤其對(duì)于痰涂片陰性患者肺結(jié)核早期診斷與治療提供有力證據(jù)。

    以傳統(tǒng)比例法藥敏為金標(biāo)準(zhǔn),Xpert MTB/RIF檢測(cè)RIF耐藥敏感度為66.7%,特異度為100.0%,和傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)行Kappa檢驗(yàn)(K=0.926),說(shuō)明Xpert MTB/RIF及傳統(tǒng)比例法對(duì)利福平耐藥的檢測(cè)有極好的一致性,與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19]。在臨床工作中,單獨(dú)對(duì)RIF耐藥較少,絕大多數(shù)均為在耐RIF同時(shí)也耐INH,即為耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB)。GUENAUI等[20]報(bào)道大約90% 對(duì)RIF耐藥的MTB會(huì)同時(shí)對(duì)INH產(chǎn)生耐藥,所以檢測(cè)是否對(duì)RIF耐藥,也可在一定程度上作為檢測(cè)是否為MDR-TB一種檢測(cè)手段,很大程度上縮短了診斷MDR-TB時(shí)間,另一方面也控制了MDR-TB的傳播。Xpert MTB/RIF檢測(cè)方法為數(shù)百萬(wàn)結(jié)核病甚至MDR-TB、XDR-TB患者帶來(lái)了新希望,被WHO遏制結(jié)核病司司長(zhǎng)Maoio Rarig lione博士評(píng)價(jià)為全球結(jié)核病診治手段的一個(gè)及其重要的里程碑。

    綜上所述,Xpert檢測(cè)與傳統(tǒng)方法相比,敏感度高、特異度高,操作方法便捷,同時(shí)能快捷檢測(cè)出RIF耐藥,很大程度上預(yù)測(cè)了MDR-TB,具有重要意義;同時(shí)可為臨床診斷,選擇和調(diào)整耐藥結(jié)核的治療方案提供參考,有廣闊的應(yīng)用前景。但由于臨床上也會(huì)遇到Xpert結(jié)果與傳統(tǒng)痰培養(yǎng)及藥敏結(jié)果不一致現(xiàn)象,如何正確分析結(jié)果并相應(yīng)的指導(dǎo)臨床診斷和治療,仍需要不斷的探索和研究。

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