中藥益腎平肝方對脫髓鞘模型小鼠社會交互行為的影響及作用靶點

吳 燕 孫作厘 馬 超 朱 虹 尹冬青 賈竑曉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院 國家精神心理疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 精神疾病診斷與治療北京市重點實驗室，北京 100088)

精神分裂癥是一種病因尚未完全闡明的復(fù)雜性的精神疾病，全球人口受累率達(dá)到0.5%～1.0%[1]，是導(dǎo)致殘疾的十種主要疾病之一，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。精神分裂癥發(fā)病有多種假說，包括多巴胺D2受體亢進(jìn)假說及神經(jīng)發(fā)育異常假說[3]。目前抗精神病藥物主要是基于多巴胺D2受體作為靶點發(fā)揮臨床治療效果，但是仍然有一部分患者無法臨床痊愈，因此從神經(jīng)保護(hù)角度開發(fā)新的抗精神病藥物是精神藥物研究的重要方向之一[4]。

益腎平肝方(Yishenpingganfang,YSPGF)[5]是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合團(tuán)隊用于治療精神分裂癥前驅(qū)期的一個有效經(jīng)驗方，其臨床研究結(jié)果表明，該中藥方劑對精神分裂癥前驅(qū)期的癥狀和認(rèn)知損害有改善作用。它的主要成分有菊花、山茱萸、防風(fēng)、何首烏等。從山茱萸[6]和何首烏[7]中提取的活性成分對神經(jīng)有保護(hù)作用。cuprizone模型[8](CPZ模型)是基于神經(jīng)發(fā)育假說的一種能夠誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失和脫髓鞘的精神分裂癥樣模型[9]。為此，本研究采用CPZ模型研究中藥益腎平肝方的藥理學(xué)作用機制[10]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡的雄性C57BL/6小鼠，共30只，體質(zhì)量(20±2)g。所有小鼠均由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。實驗環(huán)境清潔，晝夜交替12 h，正常飲食飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。本實驗通過首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號：AEEI-2018-047)。

1.2 主要藥品及試劑

雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone,CPZ)和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體髓鞘堿性蛋白抗體 (Anti-Myelin Basic Protein，MBP抗體)購自美國 Sigma公司；少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞血小板源生長因子受體α(platelet-derived growth factor receptor-alpha, PDGFR-α)抗體(PDGFR-α抗體，APA5)購自美國Abcam公司。YSPGF的各種單藥飲片購自北京同仁堂(大柵欄店)，在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院熬制成浸膏。兔二步法檢測試劑盒和DAB顯示試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

社會交互實驗系統(tǒng)(40 cm × 60 cm ×20 cm，由3個連在一起的箱子構(gòu)成，廂壁由透明有機玻璃制成)購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及處理

適應(yīng)1周后，將小鼠采用數(shù)字表法隨機分為3組，每組10只：對照組，CPZ模型組[CPZ+0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液]，YSPGF組(CPZ+YSPGF，YSPGF的給藥劑量3.54 g·kg-1·d-1)。對照組正常飲食，模型組和YSPGF組食用混合了0.2 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CPZ的特殊飼料，每日給予。建模4周后，模型組以0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射灌胃2周，YSPGF組給予中藥YSPGF(3.54 g·kg-1·d-1)灌胃2周。每周測量1次小鼠體質(zhì)量。

1.4.2 社會交互實驗

用來評定小鼠社會交往能力和對新事物的探索能力。提前將小鼠搬入測試室，使小鼠適應(yīng)實驗裝置5 min，每天1次，連續(xù)3 d。試驗當(dāng)天，在試驗1(Trial 1)中，被試小鼠被放置在中間的箱子中，并被允許在3個箱室中探索10 min。一只陌生的老鼠被關(guān)在鐵絲籠子里，被放在一邊的箱子里，另一邊的箱子里放著一個空籠子。在試驗2(Trial 2)中，一只新的不熟悉的老鼠被放在之前放空籠子的箱子里中。記錄時間均為10 min。 每次實驗結(jié)束用稀釋的乙醇徹底清潔箱籠。實驗中所需的兩只陌生小鼠需要與待測的小鼠品系、年齡、性別以及體質(zhì)量相匹配，并且該小鼠與待測小鼠不能同籠飼養(yǎng)過。整個實驗過程中，需使用相同的兩只陌生小鼠。測試過程采用視頻記錄儀(上海欣軟信息科技有限公司)記錄并分析。

1.4.3 固定標(biāo)本與取材

在完成行為學(xué)測試后，5只小鼠經(jīng)4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛腹腔麻醉，然后進(jìn)行心臟灌注，先灌注30 mL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液至肺臟和肝臟的顏色變?yōu)榛野?，接著灌?0 mL 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液，待小鼠四肢抽搐結(jié)束，僵硬即可。取出小鼠大腦，用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液固定，用于免疫組化染色研究。使用兔二步法和DAB染色法進(jìn)行染色。5只小鼠經(jīng)頸部脫臼處死，迅速取出大腦移至-80 ℃保存，用于Western blotting分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad軟件(Prism 5版本)。對3組小鼠在社會互動實驗中與陌生鼠的接觸時間(s)進(jìn)行t檢驗，以P<0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YSPGF對小鼠體質(zhì)量及小鼠胼胝體髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)表達(dá)的影響

前2周，3組小鼠體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但從第3周開始，模型組小鼠體質(zhì)量明顯減低(P<0.05)。第4周體質(zhì)量略微增加。模型組小鼠體質(zhì)量變化與YSPGF組小鼠相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1A)。 免疫組化分析結(jié)果(圖1B)顯示，模型組小鼠胼胝體MBP表達(dá)明顯下降,說明本研究CPZ模型的建立是成功的。給予YSPGF處理后該組小鼠MBP表達(dá)有一定提高，提示YSPGF對白質(zhì)損傷具有保護(hù)作用。

2.2 YSPGF對CPZ小鼠社會交互的影響

Trial 1 實驗中：對照組小鼠圍繞陌生小鼠1 (Stranger 1)的時間明顯大于圍繞空杯子(Empty)的時間(P<0.001)。YSPGF組與對照組類似，圍繞Stranger 1與Empty的時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但模型組小鼠圍繞Stranger 1與Empty的時間之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2A)。

Trial 2實驗中：對照組小鼠對新加入的Stranger 2較之已經(jīng)熟悉的Stranger 1更加感興趣(P<0.001)，與對照組不同，模型組小鼠并沒有對Stranger 2表現(xiàn)出好奇，表明其社會動力以及對新奇事物的探索能力下降；YSPGF組小鼠與新的陌生小鼠接觸時間與模型組相比，明顯增多，表明YSPGF對CPZ小鼠的社會交往能力以及對新生事物的探索能力均有改善(圖2B)。

2.3 YSPGF對小鼠海馬PDGFR-α表達(dá)的影響

Western blotting 結(jié)果(圖3)顯示，PDGFR-α經(jīng)CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘后有反應(yīng)性增生，給予YSPGF進(jìn)行干預(yù)后，PDGFR-α的代償性增生與模型組相比，呈減少趨勢，表明YSPGF對小鼠的少突膠質(zhì)細(xì)胞損害有所改善。

圖1 YSPGF對小鼠體質(zhì)量及小鼠胼胝體MBP表達(dá)的影響 Fig.1 Effects of YSPGF on body weight and MBP expression in callosum in cuprizone-induced model mice

A：weight changes in different groups,n=10;B： effects of YSPGF on MBP staining in callosum(n=5)(immunohistochemistry staining, 40×)；YSPGF:Yishenpingganfang；MBP：myelin basic protein.

圖2 YSPGF對CPZ小鼠社會交互的影響Fig.2 Effects of YSPGF on social behavior in cuprizone-induced model miceA：Trial 1; B:Trial 2; n=10. **P<0.01, ***P<0.001; YSPGF：Yishenpingganfang; CPZ:cuprizone.

圖3 YSPGF對海馬PDGFR-α表達(dá)的影響Fig.3 Effects of YSPGF on PDGFR-α expression in hippocampus in cuprizone-induced model mice

n=5,*P<0.05，**P<0.01.PDGFR-α:platelet-derived growth factor receptor-alpha;YSPGF：Yishenpingganfang.

3 討論

越來越多的證據(jù)[11-13]顯示，精神分裂癥中少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘存在異常，其證據(jù)主要來源于影像學(xué)研究[11]、尸檢[12]以及基因?qū)W研究[13]。CPZ[14]是一種銅離子的螯合劑，第一次對CPZ的描述可追溯到1950年Gustav Nilsson的實驗[15-16]。研究[17]顯示：CPZ選擇性損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞。給予不同時間的CPZ處理會誘導(dǎo)出不同的行為學(xué)改變。例如，給予小鼠2～3周CPZ處理，小鼠會出現(xiàn)更多的攀爬行為，如果給予4～6周CPZ，則表現(xiàn)為社會功能退縮。本實驗中，在給予小鼠4周CPZ后，免疫組化結(jié)果顯示，CPZ小鼠在4周后少突膠質(zhì)細(xì)胞大面積凋亡，說明筆者的CPZ小鼠模型是成功的。

在本實驗中，筆者采用CPZ誘導(dǎo)精神分裂癥樣動物行為，采用中藥YSPGF對CPZ小鼠進(jìn)行治療。本研究社會交互實驗結(jié)果顯示；第一輪實驗(Trial 1)中，對照組小鼠圍繞陌生小鼠1 (Stranger 1)的時間明顯大于圍繞空杯子(Empty)的時間，YSPGF組與對照組類似，圍繞Stranger 1與Empty的時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但模型組小鼠圍繞Stranger 1與Empty的時間之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第二輪實驗 (Trial 2) 中，對照組小鼠對新加入的Stranger 2較之已經(jīng)熟悉的Stranger 1更加感興趣，與對照組不同，模型組小鼠并沒有對Stranger 2表現(xiàn)出好奇，表明其社會動力以及對新奇事物的探索能力下降；YSPGF組社會互動行為較模型組有一定的改善；社會交互實驗主要反映實驗動物的社會交往能力和對新事物的探索能力，在一定程度上模擬了精神分裂癥的陰性癥狀(意志行為活動缺乏和情感平淡)，實驗結(jié)果表明，給予YSPGF進(jìn)行干預(yù)，CPZ小鼠的社會交往能力和探索能力有所改善，提示YSPGF對精神分裂癥的陰性癥狀有一定的改善作用。

本研究免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠胼胝體MBP表達(dá)明顯下降，Western blotting結(jié)果顯示，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞 PDGFR-α在CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘后有反應(yīng)性增生，說明經(jīng)CPZ處理后小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘有一定程度的受損。而經(jīng)YSPGF干預(yù)后，MBP表達(dá)增多和PDGFR-α減少，說明中藥方劑對少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘的受損有一定改善作用，也提示了該處方有一定神經(jīng)保護(hù)作用，也部分解釋了YSPGF改善CPZ小鼠社會交互受損的藥理學(xué)機制。

YSPGF中的山茱萸、何首烏含有神經(jīng)保護(hù)作用的成分。多項研究[18-19]表明山茱萸中的山茱萸環(huán)烯醚萜苷[6](cornel iridoid glycoside，CIG)能改善局灶性腦缺血大鼠模型的神經(jīng)功能缺損，抑制腦組織炎性反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和血管新生；并且可改善穹窿-海馬傘切斷模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，增高腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子含量和神經(jīng)元存活[20]。何首烏中提取的主要活性成分——四羥芪葡萄糖苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，可以改善動物的記憶能力。這些研究結(jié)果間接支持了本研究所發(fā)現(xiàn)的YSPGF的神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究只是用社會交互行為模型探討了YSPGF對精神分裂癥的陰性癥狀的改善作用，今后應(yīng)該增加其他行為模型觀察該方對精神分裂癥的多維治療效果，如用Y迷宮觀察該方對CPZ小鼠的工作記憶受損是否有改善作用，用PPI觀察該方對CPZ小鼠的感覺門控受損是否有改善作用。本研究只是從MBP和PDGFR-α的表達(dá)探討了YSPGF的神經(jīng)保護(hù)機制，今后應(yīng)該從NRG1-ErBb4信號通路以及氧化應(yīng)激通路更進(jìn)一步探討該方的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究只是用小樣本動物進(jìn)行了單一行為學(xué)實驗，今后應(yīng)該根據(jù)行為學(xué)的增多和作用機制的深度探討擴大樣本量。