荔枝核有效成分富集物抑制細胞攝取胰島素的機制

滿淑麗，王 瑩，馬 江，王 媛，馬 龍

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

2型糖尿病是由多種病因引起的胰島素分泌缺陷或/和胰島素作用障礙所導致的糖、蛋白質(zhì)、水、脂肪和電解質(zhì)等代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要標志．目前臨床上常用的口服降血糖藥主要包括胰島素分泌促進藥物(磺酰脲類、瑞格列奈)、α-糖苷酶抑制劑、胰島素增敏藥(雙胍類)等．荔枝核為無患子科植物荔枝(Litchi chinensis Sonn.)的干燥成熟種子，具有行氣散結、祛寒止痛作用，能夠用于治療寒疝腹痛、睪丸腫痛，性甘、微苦、溫，歸肝、腎經(jīng)[1].《本草綱目》記載：“荔枝核治癲疝氣痛，婦人血氣刺痛”．含有荔枝核(litchi semen，LSE)的復方合劑對降低糖尿病小鼠血糖、血脂的效果與臨床降糖藥二甲雙胍效果相似[2]，二甲雙胍可以通過激活肌肉等組織中的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)[3]，抑制因脂肪酸誘導產(chǎn)生的胰島素抵抗(IR)[4]．荔枝核提取物可以通過改善糖尿病大鼠的氧化應激、炎癥損傷[5]、脂代謝等以減輕對大鼠器官的損傷程度[6]．前期實驗[6]發(fā)現(xiàn)其與糖代謝、脂代謝相關，而 AMPK是調(diào)控糖代謝、脂代謝通路的直接蛋白．因此，猜測荔枝核提取物對脂代謝的調(diào)節(jié)主要是通過對組織器官中 AMPK的含量進行調(diào)節(jié)．本文構建了胰島素抵抗細胞模型，深入探討荔枝核提取物對 IR細胞 AMPK的轉錄和翻譯表達量的影響．

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

干燥的荔枝種子(核)于2014年12月購自云南，經(jīng)天津科技大學生物工程學院王春霞老師鑒定為藥典正品．人肝癌細胞 HepG2由中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所提供．

甲醇、二甲基亞砜和乙腈，分析純，天津市康科德科技有限公司；蘆丁根皮苷，四川省維克奇生物科技有限公司；薯蕷皂苷，上海研拓生物科技有限公司；磷酸鉀、二甲基亞砜(DMSO)，天津市化學試劑二廠．

9700型 PCR擴增儀，美國 Applied Biosystems公司；Agilent 7980A型氣相色譜儀、Agilent 5975C型質(zhì)譜檢測器，安捷倫公司；凝膠成像儀，美國Pharmacia Biotech公司；TGL-16C型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；D-101型大孔樹脂，河北翔泰藍星精細化工有限公司．

1.2 荔枝核有效成分提取方法及含量測定

稱取荔枝核 1kg洗凈，烘干破碎，依次用 95%、60%、30%乙醇和去離子水煮 2h，每種溶劑重復兩次，收集所有液體混合，濃縮．使用大孔樹脂柱[4,6]富集荔枝核不同極性層，依次用去離子水和體積分數(shù)為30%、50%、70%的乙醇為洗脫液依次洗脫．對洗脫液分別旋轉蒸發(fā)，烘干后獲得 3種提取層記為LSE30、LSE50、LSE70，準確稱量并記錄．

總多酚含量的測定：以 0.1g/mL沒食子酸的水溶液為標準品，繪制標準曲線．分別取 10mg LSE30、LSE50、LSE70，加蒸餾水定容至 10mL．取1mL置于10mL容量瓶中，加入6mL蒸餾水，溶解均勻后，再加入 0.5mL福林試劑，1min后加入 10%碳酸鈉溶液1.5mL，混勻定容．75℃水浴加熱10min，在 765nm 處測定吸光度，進行 3組平行實驗．利用回歸方程計算供試液中多酚的含量[4]．

總黃酮含量的測定：以 0.6g/mL蘆丁甲醇溶液為標準品，在 510nm 處測定吸光度，繪制標準曲線．配制0.5mg/mL LSE甲醇溶液，取1.0mL置于試管中，依次加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1mL、十水硝酸鋁溶液 0.5mL，每種試劑加完后靜置 5min，混勻后補加4%的氫氧化鈉溶液5mL，加蒸餾水至12.5mL，混勻，15min后測量其吸光度，進行 3組平行實驗.利用回歸方程計算供試液中黃酮的含量[7]．

總皂苷含量的測定：用甲醇配制 0.4g/mL薯蕷皂苷[7]為標準品，在 535nm 處(全波段掃描 535nm處有最大吸收峰)測定吸光度，繪制標準曲線．取10mg LSE加蒸餾水溶解，定容至10mL，取50μL水浴揮干，加入 4%香草醛冰醋酸溶液 40μL、高氯酸160μL，混勻后塞緊試管塞．在 55℃烘箱中反應15min，冰水浴 3min，加入 1mL冰醋酸搖勻，測定吸光度，進行 3組平行實驗．利用回歸方程計算供試液中皂苷的含量．

總多糖含量的測定：在 620nm 處測定吸收峰，以 100μg/mL葡萄糖水溶液為標準品，繪制標準曲線．準確稱量 10mg LSE，加水定容至 10mL．取1mL置于試管中，將試管置于冰水中，加入 4mL蒽酮-硫酸試液，冷卻后在沸水中煮沸 7min，重復之前冷卻操作，降至室溫，測定吸光度，進行 3組平行實驗．計算總多糖含量[8]．

原花青素含量的測定：以 1mg/mL甲醇原花青素B溶液為標準品溶液，繪制標準曲線．1mg/mL樣品溶液 20μL、4%香蘭素溶液 120μL、濃鹽酸 60μL混合，30℃暗處反應 20min．在 500nm 波長處測定吸光度，進行 3組平行實驗．利用回歸方程計算供試液中原花青素的含量[9]．

1.3 HepG2細胞胰島素抵抗模型建立

胰島素最佳濃度的確定：取對數(shù)生長期的 HepG2細胞，胰蛋白酶消化[7]，將含 2%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基置于 96孔板，細胞密度約為 106L-1．設置空白組(不包含細胞)、模型組，培養(yǎng) 24h．待細胞單層貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基，模型組的胰島素終濃度分別為 10、1、10-1、10-2、10-3μmol/L，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 36h．更換無血清培養(yǎng)基孵育 24h，檢測培養(yǎng)基上清液中剩余葡萄糖含量．

胰島素最佳作用時間的確定：設置空白組和模型組，模型組加入新鮮配制的胰島素最佳濃度的培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 24、36、48h，更換無血清培養(yǎng)基孵育24h，測定葡萄糖含量．

1.4 荔枝核提取物對胰島素耐受細胞的作用

分別設空白組(無細胞)、對照組(正常細胞)、模型對照組(胰島素抵抗細胞，不加藥)和模型加藥組(胰島素抵抗細胞，加藥 2.5、5.0mg/mL)．藥物作用1d后，分別檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量，計算各組細胞的耗糖量．

1.5 MTT法檢測胰島素抵抗模型的細胞凋亡

按照上述方法獲得具有胰島素抗性的HepG2細胞，使用血細胞計數(shù)板計數(shù)，接種于 96孔板內(nèi)，分組，分別加入 LSE30、LSE50、LSE70；作用 24h后棄去藥液，加入 0.5mg/mL MTT，置于培養(yǎng)箱中 4h后棄去上清液；加入 100μL DMSO，待結晶完全溶解后，使用酶標儀在波長 570nm 下測定吸光度，并計算細胞存活率．

1.6 Real-time PCR基因表達分析

稱取糖尿病模型大鼠肝組織 50.0mg，在液氮作用下碾碎，迅速加入1mL Trizol充分研磨，向EP管中依次加入提取的 mRNA 1～5μg、Oligo(dT)12-18 2μL，2.5mmol/L dNTP 混合物(pH 中性)8μL，滅菌蒸餾水補足至 15μL；70℃加熱 5min，冰上冷卻2min；依次加入 5×First-Strand緩沖液 4μL和TIANScript M-MLV 1μL(200U)，混勻．再向 200μL的離心管中加入 Template(＜1μg)、Primer1(10μmol/L) 1μL、Primer2(10μmol/L)1μL、10×Tap Buffer 5μL、DNTP Mixture(2.5μmol/L) 4μL、DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL ，滅菌蒸餾水補足至50μL，進行 PCR 反應．GAPDH 上游引物為 5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物為 5′-CTCACCTCCTCCAAGTTATT-3′；AMPKα2 上游引物為 5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′，下游引物為 5′-TCAGATGGGCTTATACAGC-3′．

1.7 免疫印跡實驗(Western blot)蛋白表達分析

100mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)用 RAPI裂解液稀釋 100倍．稱取 100mg肝組織冰上研磨，加入10倍體積的含有PMSF和RAPI的裂解液，將液體轉入 EP管在冰上裂解 30min，12000r/min離心15min．取上清液，加入 3倍體積的 4×SDS上樣緩沖液，100℃水浴 5min，冷卻至室溫．進行 SDSPAGE電泳實驗，電流為 150mA，時間 40min．將轉好的 PVDF膜放入封閉液中，室溫封閉 1h．然后將一抗按說明書稀釋，把膜放入一抗中室溫下孵育2h，TBST洗 5次，每次 5min．將二抗按說明書稀釋，把 PVDF膜放入二抗中，室溫下孵育 1h，TBST洗3次，每次10min；用PBS洗1次，紅外Odessy掃描儀掃描．

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用 IBM SPSS statistics軟件進行數(shù)據(jù)處理，*表示組間具有顯著差異(P＜0.05)．

2 結果與分析

2.1 荔枝核提取物定量分析結果

按照 1.2節(jié)分別獲得 LSE30、LSE50和 LSE70的質(zhì)量分別為 10.30、99.08、74.58g．通過紫外-可見分光光度法分別測得 LSE30、LSE50、LSE70中的總多酚、總黃酮、總皂苷、總多糖和原花青素的含量見表 1．LSE50中總多酚、總黃酮、總皂苷和原花青素的提取產(chǎn)率最高，而總多糖的提取產(chǎn)率隨乙醇濃度的增加而下降．

表1 荔枝核提取物各成分總含量Tab. 1 Total content of each component in LSE

2.2 胰島素抵抗模型的建立

體外胰島素抵抗作用的間接反映就是細胞對葡萄糖的利用率降低．對比圖 1(a)各組葡萄糖濃度，胰島素濃度為1μmol/L時，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度最高，細胞對胰島素的抵抗作用最強，因此選擇此胰島素濃度為細胞建模的最佳濃度．

圖1 HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立Fig. 1 Insulin resistance model established with HepG2 cell

由圖 1(b)可知，作用 24h細胞對葡萄糖的利用率最高，隨著時間的推移，細胞對葡萄糖的利用率逐漸降低，因此選擇24h為細胞建模的最佳時間．綜上所述，濃度為 1μmol/L胰島素對 HepG2細胞作用24h后的細胞即為胰島素抵抗模型細胞．

2.3 MTT法測定成模細胞的活力

采用 MTT法測定荔枝核的提取物對 HepG2細胞活力的影響，結果見表 2．隨著藥物濃度的升高，細胞的存活率逐漸降低；在相同濃度下，LSE50和LSE70的細胞存活率基本相同且低于 LSE30．為準確量化 3種樣品對細胞殺傷能力的大小，應用 SPSS 20.0軟件計算存活率達到 50%的時候的 IC50值.LSE30、LSE50和 LSE70的 IC50值分別為 24.60、11.70、12.02μg/mL．IC50值越小，則證明該樣品對HepeG2細胞殺傷能力越強．LSE50和 LSE70對HepG2細胞的殺傷能力近似相等且遠遠強于LSE30．這可能與其黃酮、多酚類物質(zhì)的含量較高有關系．

表2 各實驗組HepG2細胞存活率(n＝4)Tab. 2 HepG2 cell survival in every experimental group(n＝4)

2.4 荔枝核提取物對體外胰島素抵抗細胞模型的作用

荔枝核提取物對胰島素抵抗模型細胞的作用如圖 2所示，*表示與模型組相比有顯著差異(P＜0.05)．5.0、2.5 μg/mL的 LSE70和 LSE50都有降糖活性，組間不存在顯著差異，但與模型組相比存在顯著差異(P＜0.05)；隨著藥物濃度的升高，降糖效果會逐漸增強，但藥效增強的同時，會造成對細胞的損傷．以上實驗證明，LSE50和 LSE70活性均很好，由表 1可知組成也相當，所以下面以 LSE70實驗組為例，開展下述實驗．

圖2 荔枝核提取物對胰島素抵抗細胞模型攝取葡萄糖的促進作用Fig. 2 Effect of LSE on glucose uptake of HepG2 cells with insulin resistance

2.5 荔枝核提取物對 AMPK基因轉錄和蛋白表達的影響

以生物能量代謝調(diào)節(jié)的關鍵分子AMPK為出發(fā)點，從細胞能量代謝的角度分析降糖機制．由于AMPK 的α 亞基起催化作用，α 2亞單元在肝臟、骨骼肌和心肌中表達較高，本實驗使用的細胞為肝細胞，所以在AMPK三聚體中選擇α 2亞單元進行基因和蛋白水平的分析．用 Real-time PCR法和 Western blot法檢測相關基因和蛋白的表達，結果如圖3和圖4所示．由圖3和圖4可知：LSE組可逆轉因高濃度胰島素誘導而導致的 AMPKα 2基因水平下降以及逆轉因高濃度胰島素誘導而導致的 p-AMPK蛋白水平的下降．

圖3 荔枝核提取物對 HepG2細胞中 AMPK基因轉錄的影響Fig. 3 Effect of LSE on AMPK gene transcription in HepG2 cells

圖4 荔枝核提取物對 HepG2細胞中 AMPK蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of LSE on AMPK protein expression in HepG2 cells

3 討 論

糖尿病是威脅人類健康的主要疾病之一，病死率僅次于腫瘤和心血管疾病，且其在發(fā)達國家和發(fā)展中國家均以指數(shù)形式增加，年輕化趨勢明顯．荔枝核中富含有黃酮[8]、多酚、皂苷和多糖類化合物．荔枝核對血清中升高的丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)活性具有抑制作用，并能提高肝組織血清超氧化物歧化酶(SOD)的活力[10]，使肝細胞免受損傷，從而達到治療肝損傷目的[11]．荔枝核提取物有調(diào)節(jié)血糖、改善糖尿病糖脂代謝紊亂和預防糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的作用[6]．2型糖尿病是由肝臟葡萄糖產(chǎn)生增加、利用葡萄糖異常及胰島素分泌不足引起的，以胰島素抵抗和胰腺 β細胞功能失常為特征的疾病.AMPK是一種保守的異源三聚體，其酶活力能夠被腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)上調(diào)．該蛋白質(zhì)激酶能夠通過感受細胞能量狀態(tài)來維持真核細胞的三磷酸腺苷(ATP)生成和消耗的平衡，即形成能量穩(wěn)態(tài)．AMPK是機體保持葡萄糖平衡所必需的．由于分子機制十分復雜，藥物分子激活 AMP是一個巨大的挑戰(zhàn)，但其激活能改善由 2型糖尿病引起的代謝失衡．同時，AMPK 在調(diào)控細胞生長和增殖、建立和穩(wěn)定細胞極性、調(diào)節(jié)動物壽命、調(diào)控生理節(jié)律等方面也起著重要作用．目前有報道[6]稱荔枝核提取物可以顯著調(diào)節(jié)餐后血清中的脂類和膽固醇的含量，前期實驗發(fā)現(xiàn)其與糖、脂等代謝通路相關，而AMPK是其調(diào)控通路的直接蛋白，本實驗驗證了這一思路．Qi等[12]通過用不同體積分數(shù)的乙醇對荔枝核中不同極性層的有效成分進行提取比較后，對使用荔枝核提取物灌胃治療的糖尿病大鼠的肝臟組織的 AMPKα 2和 p-AMPK的表達量進行了比較及分析．文獻[5]報道用乙酸乙酯萃取的方法并不能對荔枝核中的原花青素起到富集的作用，但是可以起到富集荔枝核提取物中多酚和類黃酮類成分的作用．LSE50和 LSE70的化學成分和生物活性都極其相似，工業(yè)生產(chǎn)中可以將LSE50和LSE70兩層合并提?。瓵MPK通路的激活能改善由 2型糖尿病引起的代謝失衡．本研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核提取物可以阻止因高濃度胰島素誘導而導致的 AMPKα 2水平降低，調(diào)節(jié)和改善能量代謝．因此可以推測，荔枝核提取物對糖尿病模型大鼠的降糖作用可能與 AMPK的表達變化有關，相關的機制還需要進一步研究．