CRISPR/dCas9在細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的應(yīng)用及展望

鐘 成，黃龍輝，劉其敬，謝燕燕，譚之磊

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是細(xì)菌等生物體細(xì)胞內(nèi)的一種遺傳適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，細(xì)菌可以通過該系統(tǒng)抵御侵入細(xì)胞內(nèi)的 DNA[1]．它主要由 crRNA(CRISPR RNA)和相應(yīng)的 Cas(CRISPR-associated)蛋白組成．在 CRISPR系統(tǒng)中，crRNA的基因包含一段用于定位 CRISPRCas系統(tǒng)靶位點(diǎn)基因的序列，該序列是一段外源侵入至 CRISPR陣列的 DNA．crRNA主要通過結(jié)合 Cas蛋白和特異的 20nt左右的間隔序列對(duì) DNA序列進(jìn)行特異的靶邊點(diǎn)識(shí)別，并實(shí)現(xiàn)對(duì)靶位點(diǎn) DNA的切割[2-3]．通過整合外源侵入的 DNA，CRISPR 能夠記錄下外源 DNA的具體序列，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外源 DNA特定序列的切割．基于不同 CRISPR免疫系統(tǒng)中crRNA和Cas蛋白的不同，CRISPR-Cas系統(tǒng)主要通過其特征基因分為三大類型：Ⅰ型系統(tǒng)具備 cas3，Ⅱ型系統(tǒng)具備 cas9，Ⅲ型系統(tǒng)具備 cas10．在所有的CRISPR/Cas系統(tǒng)中，Ⅱ型系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單，僅需要 Cas9蛋白便能實(shí)現(xiàn)切割，因此人們最早將它改造成用于基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)[4]．

CRISPR/dCas9是通過將 CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9蛋白改造成dCas9(catalytically dead Cas9)，得到的具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的系統(tǒng)．相對(duì)于 CRISPR/Cas9系統(tǒng)，CRISPR/dCas9系統(tǒng)具備與靶位點(diǎn)結(jié)合，但不對(duì)DNA進(jìn)行切割的特點(diǎn)(圖1)．

Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)如圖2所示，它主要存在HNH和RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域以及與sgRNA(target-specific guide RNA)接觸的α-螺旋葉，其中HNH和RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域都是切割 dsDNA所必需的[5-6]．HNH和RuvC兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各自負(fù)責(zé)一條單鏈的切割，選擇其中任何一個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變可以得到具備單鏈切割能力的 Cas9n蛋白．將兩個(gè)不同突變位點(diǎn)的 Cas9n蛋白結(jié)合起來切割雙鏈，從而提高靶位點(diǎn)切割的特異性[7]．將 CRISPR系統(tǒng)中 Cas9蛋白改造成 dCas9蛋白后，蛋白就能方便精準(zhǔn)地被引導(dǎo)至靶位點(diǎn)．同時(shí)，對(duì)HNH和RuvC兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的D10A和H840A氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變可以獲得剪切失活的Cas9蛋白[8].基于此，研究人員除了將dCas9蛋白直接用于轉(zhuǎn)錄抑制外，也融合了不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的因子，得到了一系列基于CRISPR/dCas9的轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具．

圖1 Cas9蛋白與gRNA及靶位點(diǎn)的結(jié)合過程Fig. 1 The binding process of Cas9 to gRNA and target sites

圖2 Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Schema of Cas9 protein structure

Cas9首先需要識(shí)別一個(gè)短的原型間隔區(qū)相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)，再通過 sgRNA中和 DNA互補(bǔ)的 20nt與 DNA結(jié)合．結(jié)合后的Cas9-sgRNA復(fù)合物就變得非常穩(wěn)定；體外結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，這一反應(yīng)在結(jié)合后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)幾乎是不可逆的[9]．通過對(duì) CRISPR系統(tǒng)的改造，其已經(jīng)在激活或抑制特定靶位點(diǎn)基因表達(dá)以及表觀修飾等領(lǐng)域取得了重大突破[10-11]．CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種基因編輯工具，為基因工程帶來了巨大的變革，許多綜述已經(jīng)詳細(xì)闡述了其在真核生物中的應(yīng)用[12-16]．相比 CRSPR/Cas9系統(tǒng)，CRSPR/dCas9系統(tǒng)是在其基礎(chǔ)上發(fā)展而來的轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具．該系統(tǒng)作為轉(zhuǎn)錄抑制工具方面已在多種細(xì)菌中得到應(yīng)用，而該系統(tǒng)在細(xì)菌作為轉(zhuǎn)錄激活工具的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道．本文以 CRSPR/dCas9為例，首先對(duì) CRISPR干擾和激活在細(xì)菌中的應(yīng)用和研究進(jìn)展進(jìn)行了介紹，然后總結(jié)和討論了在細(xì)菌中構(gòu)建該系統(tǒng)存在的問題．

1 CRISPR干擾

細(xì)菌 CRISPR 干擾(CRISPR interference，CRISPRi)在大腸桿菌(E.coli)中已有大量研究[10-11,17].在大腸桿菌中，dCas9-sgRNA復(fù)合物通過阻斷 RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)與啟動(dòng)子 DNA 的結(jié)合或通過阻斷轉(zhuǎn)錄的延伸抑制轉(zhuǎn)錄(圖 3)，這一點(diǎn)已被深度測(cè)序證明[10-11,18]．靶向非模板鏈的延伸區(qū)段是最有效的[19]．RNA測(cè)序表明這種抑制具有高度的特異性[10]．CRISPRi已被用于模式菌株如大腸桿菌中的遺傳回路控制[10]以及結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中基因表達(dá)的調(diào)控[20]，并通過 CRISPRi改變代謝通量，從而改變代謝途徑[21]．研究[22]顯示，CRISPRi系統(tǒng)已成功應(yīng)用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、人類微生物群共生菌擬桿菌(Bacterioides sp.)以及產(chǎn)生醫(yī)學(xué)相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物的放線菌目中．

圖3 CRISPRi系統(tǒng)的作用機(jī)制Fig. 3 Mechanism of the CRISPRi System

在細(xì)菌中dCas9僅需通過gRNA的引導(dǎo)與靶位點(diǎn)結(jié)合就能有效地抑制基因的表達(dá)．而與原核生物相比，在真核生物中dCas9蛋白不能明顯地抑制基因表達(dá)，Cas9蛋白需要與轉(zhuǎn)錄抑制蛋白結(jié)構(gòu)域(KRAB)融合，實(shí)現(xiàn)抑制基因的轉(zhuǎn)錄[23](圖 3)．與傳統(tǒng)的調(diào)控基因表達(dá)的技術(shù)相比，CRISPRi的優(yōu)勢(shì)明顯[24-26]．第一，僅通過在sgRNA中插入一個(gè)新的20nt堿基配對(duì)區(qū)域就可以很容易地抑制新靶點(diǎn)．第二，由于CRISPRi構(gòu)建完成后只需要改變其中的 20nt就可以靶向不同的基因，因此可以使用合并克隆策略，將20nt文庫(kù)與CRISPRi載體整合進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建[24,27-29].通過文庫(kù)的構(gòu)建，可以高通量地篩選出理想表型的菌株，并找到影響該表型的基因，從而進(jìn)一步指導(dǎo)理性地改造菌株．第三，由于 CRISPRi可以是誘導(dǎo)型的，所以它能夠通過部分抑制而操縱基因表達(dá)[20]．

除了傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法外，近年來有研究顯示可以通過光遺傳工具調(diào)控CRISPRi的表達(dá)．例如，通過光誘導(dǎo) CRISPRi的表達(dá)調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因的表達(dá)[30-31]．而這一策略在發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用雖未報(bào)道，但其在特定的發(fā)酵條件(比如靜息發(fā)酵)下的基因調(diào)控同樣具有相當(dāng)價(jià)值．CRISPRi可與多種 sgRNA在同一細(xì)胞中同時(shí)對(duì)多種基因的表達(dá)進(jìn)行干擾[10,17]．這對(duì)于需要調(diào)節(jié)許多基因表達(dá)優(yōu)化代謝途徑的應(yīng)用很重要，它可以簡(jiǎn)單快速地探究多個(gè)基因的表達(dá)對(duì)代謝通路的影響．由于這一系統(tǒng)構(gòu)建方便，而在一些倍增時(shí)間極長(zhǎng)的細(xì)菌中進(jìn)行基因編輯又非常耗時(shí)，因此通過這種方法探究代謝途徑的應(yīng)用價(jià)值具有明顯的優(yōu)勢(shì).

然而，由于 dCas9阻斷了 RNA聚合酶的延伸，操縱子中的下游基因的表達(dá)也同樣會(huì)受到干擾，相對(duì)于基因組編輯來說，這是一個(gè)不可忽視的缺陷．與CRISPR編輯的情況一樣，在CRISPRi對(duì)生長(zhǎng)所必需基因進(jìn)行干擾的時(shí)候，生存選擇壓力可能導(dǎo)致CRISPR系統(tǒng)發(fā)生突變甚至不再工作．最近，Cui等[19]將包含92000種特異性靶點(diǎn)的CRISPRi文庫(kù)應(yīng)用于大腸桿菌中高通量篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，sgRNA中靠近 PAM序列的12nt的種子序列中的5個(gè)特定的核苷酸就能造成菌株產(chǎn)生適應(yīng)性缺陷．同時(shí)，他們也發(fā)現(xiàn)隨著dCas9濃度降低，適應(yīng)性缺陷也會(huì)降低．而 dCas9在低濃度時(shí)也能夠明顯抑制靶點(diǎn)基因的表達(dá)．因此，在構(gòu)建細(xì)菌的CRISPRi過程中優(yōu)化dCas9的表達(dá)量就顯得尤為重要．

2 CRISPR激活

CRISPRa(CRISPR activition)是一種基于CRISPR/dCas9的轉(zhuǎn)錄激活工具．CRISPR/dCas9系統(tǒng)要實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活，需要dCas9蛋白與轉(zhuǎn)錄激活因子融合或者在 sgRNA的末端融合一段 scRNA(small cytoplasmic RNA)來募集能激活基因表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白，從而激活或增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄．大腸桿菌CRISPRa系統(tǒng)中，dCas9與 RNA聚合酶的 ω亞基(dCas9∷ω)融合[11]，在特異性的 sgRNA 引導(dǎo)下，RNA聚合酶被聚集到啟動(dòng)子的上游位置，從而激活轉(zhuǎn)錄[14](圖 4)．真核微生物中有 SAM、SunTag和VP64-p65-Rta(VPR)等系統(tǒng)[21,24-25]．基于對(duì)不同啟動(dòng)子的特征分析表明，可能存在有效激活的狹窄區(qū)域，即 dCas9∷ω過于接近啟動(dòng)子則發(fā)生抑制，并且當(dāng)dCas9∷ω的結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)離啟動(dòng)子時(shí)，激活則會(huì)失敗.這一特性雖然使 CRISPRa不能明確界定靶位點(diǎn)，但同時(shí)也增強(qiáng)了 CRISPRa系統(tǒng)的特異性．CRISPRa對(duì)弱啟動(dòng)子的激活有明顯效果[11]．由于基因組中啟動(dòng)子的具體位點(diǎn)不能明確界定，因此該系統(tǒng)需要進(jìn)一步的研究和優(yōu)化才能廣泛適用．研究[11]顯示，大腸桿菌CRISPRa系統(tǒng)需要在缺乏ω因子的菌株中才能工作.

相對(duì)于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具，CRISPRa系統(tǒng)繼承了 CRISPR/dCas9系統(tǒng)在構(gòu)建方面的簡(jiǎn)單快捷的優(yōu)勢(shì)．另外，其在利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控探究基因功能方面能夠彌補(bǔ) CRISPRi對(duì)表達(dá)弱的基因不明顯這一缺陷．不同基因表達(dá)的強(qiáng)弱不同，當(dāng) CRISPRa用于強(qiáng)啟動(dòng)子的時(shí)候其效果就不十分顯著，而當(dāng) CRISPRi用于弱啟動(dòng)子的時(shí)候其效果也可能會(huì)不明顯．因此，若利用 CRISPRa探究加強(qiáng)表達(dá)基因的功能或用CRISPRa探究削弱表達(dá)基因的功能，效果則不會(huì)顯著．與此相反，當(dāng) CRISPRa用于弱啟動(dòng)子或CRISPRi用于強(qiáng)啟動(dòng)子的時(shí)候其效果則可能變得顯著．因此，將二者分別用于同一基因的激活和弱化的時(shí)候，就可以抵消之前二者的缺陷．設(shè)計(jì)不同的 20nt序列和scRNA序列可以實(shí)現(xiàn)分別對(duì)不同基因的抑制和激活，并且兩個(gè)系統(tǒng)互不干擾[34]．結(jié)合 CRISPRi和CRISPRa就可以在基因組規(guī)模上進(jìn)行基因功能的探究[32](圖 5)．CRISPRa系統(tǒng)的另一個(gè)應(yīng)用是探究抗生素作用機(jī)制．為了實(shí)現(xiàn)這一效果，可能需要不依賴于啟動(dòng)子的精確間距的 CRISPRa的策略．研究人員通過在 sgRNA的末端連接長(zhǎng)而靈活的連接子(一段能夠與激活子結(jié)合的 RNA片段)，利用連接子將激活子聚集在 dCas9附近[24,28](圖 4)，以減少CRISPRa對(duì)間距的依賴性．

圖5 同時(shí)激活和抑制基因組上不同基因Fig. 5 Simultaneous activation and depression of different genes on a genome scale

3 應(yīng) 用

由于細(xì)菌的多樣性，CRISPR技術(shù)在細(xì)菌中的應(yīng)用卻不如哺乳動(dòng)物中那么成熟[33]．CRISPR系統(tǒng)在 γ變形菌門中基因編輯的實(shí)現(xiàn)標(biāo)志著在原核微生物中從傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)到利用 CRISPR系統(tǒng)對(duì)基因組編輯的轉(zhuǎn)變[34-35]．厚壁菌和放線菌中的應(yīng)用標(biāo)志著研究人員正將這一便捷的技術(shù)轉(zhuǎn)移到以前缺乏足夠遺傳改造工具的細(xì)菌中[36-37]．將CRISPR/dCas9系統(tǒng)應(yīng)用到一株新的菌株中主要會(huì)經(jīng)歷系統(tǒng)的選擇與構(gòu)建、靶位點(diǎn)的選擇和gRNA的設(shè)計(jì)3個(gè)過程，本節(jié)將結(jié)合筆者實(shí)際研究和文獻(xiàn)總結(jié)，從這 3個(gè)方面探討CRISPR/dCas9在細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的應(yīng)用以及應(yīng)用過程中存在的問題．

(1) 利用 CRISPR/dCas9系統(tǒng)在一株新的細(xì)菌中有效地調(diào)控基因的表達(dá)需要選擇合適的系統(tǒng)．而在系統(tǒng)選擇的過程中，靶點(diǎn)基因表達(dá)的強(qiáng)弱是選擇系統(tǒng)的主要依據(jù)．這是因?yàn)橛迷撓到y(tǒng)去激活表達(dá)強(qiáng)的基因或者弱化表達(dá)弱的基因都不會(huì)有明顯的效果.因此，利用 CRISPR/dCas9探究細(xì)菌中某一基因功能的時(shí)候，將激活和弱化二者結(jié)合運(yùn)用或許會(huì)取得更明顯的效果．

(2) 需要考慮CRISPR/dCas9的表達(dá)系統(tǒng)．一方面，由于原核微生物的多樣性，很難找到一個(gè)能在所有細(xì)菌中共用的表達(dá)系統(tǒng)，因此要將CRISPR系統(tǒng)引入一株新的菌株，需要選擇能在宿主中工作的表達(dá)系統(tǒng)．另一方面，則是要在較低的水平表達(dá) dCas9蛋白，這是因?yàn)檫^量的表達(dá)dCas9蛋白會(huì)對(duì)宿主造成毒害．而將dcas9基因的表達(dá)量控制在較低的表達(dá)水平則會(huì)有效地減少 CRISPR/dCas9系統(tǒng)對(duì)宿主的毒性[19]. 并且，Cas9-sgRNA復(fù)合物與基因結(jié)合后就變得非常穩(wěn)定；體外結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，這一反應(yīng)在結(jié)合后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)幾乎是不可逆的[9]．總而言之，在一個(gè)新的菌株中構(gòu)建 CRISPR/dCas9系統(tǒng)時(shí)，需要考慮質(zhì)粒的拷貝數(shù)、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱和密碼子的適應(yīng)度的優(yōu)化，讓該系統(tǒng)達(dá)到既能對(duì)靶位點(diǎn)基因有效地調(diào)控又不至于對(duì)宿主帶來毒性的效果．

(3) 需要選擇合適的靶位點(diǎn)．與 CRISPR/Cas9這一基因編輯工具只需要考慮 Cas9-sgRNA復(fù)合物與靶位點(diǎn)的結(jié)合效率不同的是，在選取 CRISPR/dCas9靶位點(diǎn)的時(shí)候還需要考慮復(fù)合物結(jié)合靶位點(diǎn)后對(duì)基因調(diào)控的效果．在同一操縱子內(nèi)，選取不同的靶位點(diǎn)具有不同的調(diào)控效果．就CRISPRi而言，可以選與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子或基因內(nèi)部結(jié)合．當(dāng)在靶基因內(nèi)部選取靶位點(diǎn)時(shí)，只有以編碼鏈中的序列為靶位點(diǎn)時(shí)才能抑制基因的表達(dá)．而當(dāng)將靶向位點(diǎn)選取在啟動(dòng)子的時(shí)候，以 DNA雙鏈的任何一條鏈作為靶位點(diǎn)都會(huì)對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制．當(dāng)操縱子中有多個(gè)基因時(shí)，靶向上游基因能抑制下游基因的表達(dá)，而靶向下游基因?qū)ι嫌位虻谋磉_(dá)幾乎沒有影響[19].與 CRISPRi靶位點(diǎn)選取不同的是，CRISPRa需要將靶位點(diǎn)選在啟動(dòng)子上游位置才能激活基因的表達(dá)[11].由于 CRISPRa可能存在狹窄的有效激活域，因此選取靶位點(diǎn)的時(shí)候最好不要太靠近啟動(dòng)子，也不要距離啟動(dòng)子太遠(yuǎn)．

(4) 設(shè)計(jì)有效的 sgRNA．sgRNA 的設(shè)計(jì)必須符合兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：靶向具有 PAM 的區(qū)域和最小化的脫靶率．選擇靶向PAM序列是由于CRISPR雖然能靈活且精確地將 Cas9靶向基因組上不同位置，但靶向DNA特異位點(diǎn)首先需要Cas9識(shí)別PAM序列[8-9]，然后通過 20nt左右的靶序列與 sgRNA的間隔區(qū)堿基配對(duì)．選擇與PAM相鄰靶位點(diǎn)完全匹配的20nt序列能有效降低脫靶率．這是因?yàn)殡m然不完全匹配的靶位點(diǎn)仍然可以與 dCas9-sgRNA復(fù)合物結(jié)合，但抑制效果最強(qiáng)的 sgRNA都與 PAM 相鄰靶位點(diǎn)完全匹配．在sgRNA的3′末端或與PAM序列相鄰的12個(gè)核苷酸中的單個(gè)錯(cuò)配會(huì)明顯降低 dCas9-sgRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制作用．sgRNA與靶點(diǎn)之間的錯(cuò)配將進(jìn)一步降低抑制的效果[10-11]．抑制效果也可以通過改變靶點(diǎn)匹配所在基因內(nèi)的位置來調(diào)整，這是由于目的基因的3′堿基或sgRNA與模板鏈結(jié)合的位置都會(huì)影響抑制效果[10,20]．Bowtie等計(jì)算工具可用于比較PAM 相鄰的靶位點(diǎn)，使用加權(quán)算法可以幫助丟棄具有潛在脫靶效應(yīng)的sgRNA[29-30]．

4 展 望

相對(duì)于在哺乳動(dòng)物中CRISPRi需要與dCas9融合染色質(zhì)沉默子(KRAB)這一特點(diǎn)[29,38]，在細(xì)菌中CRISPRi系統(tǒng)僅 dCas9就能對(duì)基因的表達(dá)起到明顯的抑制效果[10]．因此，細(xì)菌 CRISPRi中 sgRNA的設(shè)計(jì)規(guī)則可能與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的規(guī)則不同；這些規(guī)則可以在包含大量的 sgRNA文庫(kù)實(shí)驗(yàn)中，利用深度測(cè)序測(cè)試sgRNA的功效進(jìn)行確定．由于CRISPRi對(duì)基因的抑制會(huì)影響操縱子下游基因的表達(dá)，而不是僅對(duì)個(gè)別基因的抑制，因此 CRISPRi只適用于操縱子的篩選．另外，高濃度表達(dá) dCas9對(duì)細(xì)菌造成適應(yīng)性缺陷，因此在利用 CRISPR/dCas9系統(tǒng)探究細(xì)菌基因功能的時(shí)候，優(yōu)化dCas9的表達(dá)量就顯得尤為重要．

在細(xì)菌中構(gòu)建 CRISPRi系統(tǒng)的過程中，還必須解決 CRISPRi系統(tǒng)在不同細(xì)菌中通用性的問題．由于不同細(xì)菌之間的種間差異較大，因此很有可能不會(huì)有通用的 CRISPRi系統(tǒng)能在所有細(xì)菌中工作．而將系統(tǒng)中的組件模塊化標(biāo)準(zhǔn)化方法(比如可以通過酶切方法輕易地替換系統(tǒng)中的復(fù)制子或啟動(dòng)子等原件)或許更適用于CRISPR系統(tǒng)在不同細(xì)菌中的擴(kuò)展．

與 RNAi或其他已知的調(diào)控基因表達(dá)的方法(基因過表達(dá)，TALE或ZF介導(dǎo)的調(diào)控)相比，CRISPRi/a具備設(shè)計(jì)簡(jiǎn)易性和高特異性的特點(diǎn)[23-24,38]．基于這些特點(diǎn)，研究人員一方面可以通過其直接控制內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)．另一方面也可以在該系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改造，以適應(yīng)不同的研究目的．比如，在基因互作方面，科研人員將 CRISPR/dCas9系統(tǒng)與熒光蛋白結(jié)合用于基因定位，研究活細(xì)胞中基因組的三維結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特征[7,10]；在調(diào)控基因表達(dá)方面，研究人員將光遺傳工具與 CRISPR/dCas9結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了通過光誘導(dǎo)抑制基因的表達(dá)[26,32]．而這些也為在細(xì)菌中進(jìn)一步研究 CRISPR/dCas9提供了思路.CRISPR/dCas9技術(shù)以調(diào)控基因表達(dá)開始出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室，相信其還有更多的擴(kuò)展功能等待著研究人員去開發(fā).