miR-219與TGFBR2的調控關系在腎臟纖維化中的作用*

李霜青， 應 俊， 許旭春

(金華市中心醫(yī)院， 浙江 金華 321000)

腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病進展到終末期腎病的共同途徑，其臨床病理形態(tài)包含腎小球硬化，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)異常增多及過度沉積和腎小管間質纖維化，導致腎功能進行性下降等[1]。雖然腎臟纖維化早期所造成的腎臟損傷是可逆的，但在瘢痕形成期纖維化損傷則不可逆轉，因此，探尋相關生物學指標在防治和延緩纖維化進展中的作用，對腎臟纖維化治療策略的制定和預后風險評估具有重要意義。多項研究提示，轉化生長因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)在腎臟纖維化過程中是一種關鍵促纖維化因子，具有促進腎小球硬化、腎間質纖維化和ECM沉積等作用[2]。TGF-β信號傳導需要轉化生長因子βⅠ型受體(TGF-β receptor type 1，TGFBR1)和TGFBR2共同參與，且TGFBR1需要TGFBR2的參與才能激活并與TGF-β結合從而進一步激活下游通路，引發(fā)一系列纖維化效應[3]，因此，TGFBR2在TGF-β信號通路中具有重要作用。研究發(fā)現多種微小RNA(microRNA，miRNA，miR)與腎臟纖維化密切相關，具有成為腎臟纖維化診斷指標及治療靶點的潛力[4]。本研究通過分析miR-219靶向調控TGFBR2在腎臟纖維化中發(fā)揮的作用，并觀察miR-219對單側輸尿管閉塞(unilateral ureteral occlusion，UUO)小鼠腎臟纖維化進程的影響，為診斷及治療腎臟纖維化提供新的治療方向和研究靶點。

材 料 和 方 法

1 研究對象

收集2017年9月～2018年3月在我院就診的70例腎臟纖維化患者，其中男性32例，女性38例；年齡33～65歲，平均年齡(49.36±10.87)歲。選取同期來本院體檢的20例健康人設為對照組，其中男性10例，女性10例；年齡32～66歲，平均年齡(48.60±8.85)歲。2組均符合知情同意原則，性別和年齡等一般資料比較差異無統計學顯著性，具有可比性。入組標準為腎臟纖維化患者均經穿刺活檢證實為腎臟纖維化。排除標準為排除合并泌尿系感染、糖尿病、孕婦和惡性腫瘤的患者。

2 方法

2.1外周血采集 2組均于清晨空腹狀況下抽取外周靜脈血3 mL(采用一次性血清分離膠管)，待血清析出后以1 000 ×g離心10 min，取上層血清保存至-80 ℃冰箱待檢測。

2.2建立UUO小鼠模型 選取7周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠20只， 動物合格證號為SYXK(浙)2018-0012，體質量(20±2) g，隨機分為UUO組和假手術(sham)組。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±1) ℃，相對濕度(55±5) %。小鼠經腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)，約2 min小鼠麻醉后，UUO組(n=10)取仰臥位固定小鼠，術前消毒，于無菌條件下，取腹部正中白線為手術切口，尋找左側輸尿管并鈍性分離輸尿管至腎門，于小鼠腎臟下極和腎門處分別用絲線結扎左側輸尿管，并于兩結扎處之間剪斷輸尿管，右側輸尿管不予任何處理，縫合腹膜，消毒，縫合腹直肌和皮膚，再次消毒。假手術組(n=10)小鼠除不結扎輸尿管外，其余操作與UUO組相同。

2.3RT-qPCR實驗 采用TRIzol 法提取總RNA，實驗按照試劑盒說明書中步驟進行。將提取的總RNA按照反轉錄試劑盒的說明書進行逆轉錄，合成cDNA。按照試劑盒說明書進行qPCR反應。miR-219的上游引物序列為 5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，下游引物序列為 5’-TGCTTGATTGTCCAAACG-3’；U6的上游引物序列為 5’-GCAGTGCTTAGCTGGTTGT-3’，下游引物序列為 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；TGFBR2的上游引物序列為 5’-CTAACCTGCTGCCTGTGTGA-3’，下游引物序列為 5’-TCTGGAGCCATGTATCTTGC-3’；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的上游引物序列為 5’-TACTGCCGAGCGTGAGAT-3’，下游引物序列為 5’-GCTTCCTCGTATTCCTGTTT-3’；結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)的上游引物序列為 5’-CAAAGCAGCTGCAAATACCA-3’，下游引物序列為 5’-GGCCAAATGTGTCTTCCAGT-3’；Ⅰ型膠原α1鏈(type Ⅰ collagen α1, COL1A1)的上游引物序列為 5’-AACATAATCCGCAGTGGCCT-3’，下游引物序列為 5’-CTCCTGTTGCGTTGCTCCTT-3’；COL3A1的上游引物序列為 5’-CCCAGAACATCACATATCAC-3’，下游引物序列為 5’-CAAGAGGAACACATATGGAG-3’；GAPDH的上游引物序列為 5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游引物序列為 5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。PCR反應程序為： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 60 s， 35個循環(huán)； 72 ℃ 7 min。每個檢測指標設3個平行樣，每次檢測結果均重復3次。

2.4細胞培養(yǎng)和轉染 大鼠腎成纖維細胞NRK49F在37 ℃、5% CO2條件下，置于含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3 d換液1次，3～5 d傳代1次。按照說明書分別將miR-219模擬物(miR-219 mimics)和陰性對照(negative control) miRNA mimics (NC)轉染進NRK49F細胞。

2.5螢光素酶報告分析 構建TGFBR2野生型3’-UTR螢光素酶報告基因質粒pMIR-WT，并以pMIR-WT質粒為模板，利用PCR搭橋法(overlapping PCR)構建其潛在結合位點突變型報告基因質粒pMIR-Mut。將miR-219mimics、內參照海腎螢光素酶以及pMIR-WT和pMIR-Mut報告基因質粒共轉染進NRF49F細胞中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，用Passive Lysis Buffer裂解細胞后分析雙螢光素酶活性。

2.6Western blot實驗 采用含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS和蛋白酶抑制劑及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液分離蛋白質。通過SDS-PAGE進行分離，按說明書進行Western blot實驗檢測TGFBR2和α-SMA的蛋白表達。實驗重復3次。

2.7HE和Masson’s trichrome染色 切取UUO小鼠腎臟標本并用固定液固定，浸蠟包埋，固定于切片機上切片成3～5 μm薄片，按照說明書分別采用HE染色和Masson’s trichrome染色對假手術組小鼠、UUO組小鼠和UUO+miR-219組小鼠腎臟進行纖維化分析。

3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組獨立樣本均數比較采用t檢驗，多組獨立樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組組間多重比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-219在腎纖維化患者血清及UUO小鼠腎臟中的水平

RT-qPCR檢測結果顯示，miR-219在腎纖維化患者血清中的水平明顯低于對照組(P<0.01)，見圖1A。與假手術組小鼠相比，miR-219在UUO小鼠腎臟組織內表達水平顯著降低(P<0.01)， 見圖1B。以上結果均提示miR-219可能與腎臟纖維化存在相關性。

Figure 1.The miR-219 expression in the serum of patients with renal fibrosis (A) and the renal tissue of UUO mice (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vssham group.

圖1miR-219在腎纖維化患者及UUO小鼠中表達的變化

2 miR-219抑制NRK49F細胞α-SMA的表達

使用AngII(10-7mol/L)刺激NRK49F細胞24 h后，RT-qPCR檢測結果顯示，相比對照組，AngII處理組中miR-219的表達水平明顯降低(P<0.01)，見圖2A。將miR-219 mimics和NC分別轉染進NRK49F細胞中并采用AngII(10-7mol/L)進行刺激24 h，Western blot檢測結果顯示，相比對照組，AngII處理組中的α-SMA蛋白表達升高，但AngII+miR-219 mimics組中的α-SMA蛋白表達水平明顯低于AngII處理組(P<0.01),見圖2B，這表明AngII刺激NRK49F細胞對α-SMA表達的促進效果會被miR-219 mimics抑制，提示miR-219可下調α-SMA的表達并抑制AngII誘導的腎臟細胞纖維化。

3 miR-219通過結合NRK49F細胞TGFBR2的 3’-UTR來抑制TGFBR2的表達

通過microRNA靶基因數據庫TargetScan進行篩選預測，確定miR-219的潛在靶基因為TGFBR2，見圖3A。通過構建TGFBR2野生型3’-UTR螢光素酶報告基因質粒pMIR-WT及突變型報告基因質粒pMIR-Mut，驗證TGFBR2為miR-219的靶基因。

Figure 2.The expression of α-SMA at mRNA and protein levels was inhibited by miR-219. A: the miR-219 expression in the NRK49F cells treated with AngII; B:the protein expression of α-SMA in the NRK49F cell treated with AngII and/or miR-219 mimics was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsAngII group.

圖2miR-219抑制α-SMA的表達

將miR-219 mimics和NC miRNA mimics以及pMIR-WT和pMIR-Mut報告基因質粒共轉染進NRF49F細胞中，雙螢光素酶檢測結果顯示，miR-219 mimics可明顯抑制pMIR-WT質粒螢光素酶的活性(P<0.01)；而對pMIR-Mut螢光素酶的活性無明顯影響,見圖3B。該結果顯示miR-219可結合TGFBR2的3’-UTR并抑制TGFBR2的表達。

4 miR-219抑制TGFBR2的mRNA及蛋白表達水平

為進一步證明miR-219對NRK49F細胞TGFBR2的調控作用，采用RT-qPCR檢測發(fā)現，相比NC組，miR-219 mimics轉染組TGFBR2的 mRNA表達明顯下降(P<0.01)，見圖4A。同時Western blot檢測結果顯示，相比NC組，miR-219 mimics轉染組TGFBR2蛋白的表達量明顯下降(P<0.01)，見圖4B。以上結果表明miRNA-219可以抑制TGFBR2的mRNA及蛋白表達。

5 miR-219抑制α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1的mRNA表達水平

RT-qPCR檢測對照組和miR-219 mimics轉染組中腎臟纖維化因子α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1的mRNA表達水平，結果顯示，相比對照組，miR-219 mimics轉染組中上述纖維化因子的mRNA表達水平均明顯降低(P<0.01)，見圖5。這些結果表明，miR-219能夠抑制腎臟纖維化的進程。

6 miR-219對UUO小鼠腎臟纖維化的影響

HE染色顯示，假手術組小鼠腎小管和腎小球結構清晰，上皮細胞排列整齊，小管基底膜較完整，間質中未見明顯炎癥細胞浸潤；UUO小鼠腎小球擴張，上皮細胞變性萎縮壞死；但UUO小鼠在注射miR-219(30 mg/kg，每隔3天注射1次)后，腎纖維化進程則明顯受到抑制。Masson’s trichrome染色檢測發(fā)現，相比UUO小鼠，UUO+ miRNA-219組小鼠腎臟纖維化區(qū)域減小，細胞外基質沉積變少，見圖6A。同時我們還觀察到UUO+ miR-219組小鼠腎臟組織中COL1A1和COL3A1的mRNA表達水平均明顯低于UUO小鼠(P<0.05)，見圖6B。上述結果表明miR-219在UUO小鼠的腎纖維化進程中發(fā)揮抑制作用。

Figure 3.TGFBR2 was the target gene of miR-219 in the NRK49F cells. A: the predicted consequential of target region; B: the dual-luciferase reporter analysis of target gene and miR-219. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspMIR group and pMIR-Mut group.

圖3NRK49F細胞的TGFBR2是miR-219的靶基因

Figure 4.The expression of TGFBR2 at mRNA and protein le-vels was inhibited by miR-219 in the NRK49F cells. A:the mRNA expression of TGFBR2 in the NRK49F cells treated with miR-219 was determined by RT-qPCR; B:the protein expression of TGFBR2 in the NRK49F cells treated with miR-219 mimics was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖4miR-219抑制NRK49F細胞TGFBR2的mRNA及蛋白表達水平

討 論

腎臟纖維化的主要臨床表現為腎小球硬化，腎小管萎縮，ECM異常增多及過度沉積和腎間質纖維化等，其病理過程有多種因子的參與。當前研究發(fā)現，TGF-β/Smad信號通路、MAPK信號通路和腺苷信號通路等多種信號通路激活與腎臟纖維化緊密相關[5]，且隨著對miRNAs研究的不斷深入，越來越多的miRNAs被發(fā)現與腎纖維化具有相關性。

miRNA是一類具有高度保守性的長度約為19～25 nt的非編碼單鏈小分子RNA，其通過與靶基因mRNA的3’-UTR完全或不完全配對，在轉錄后水平抑制基因表達。研究報道，miR-200a可通過靶向調控TGF-β2抑制腎臟纖維化的發(fā)展[6]；miR-29b在大鼠腎臟髓質上皮細胞中可通過調控COL1A1，COL3A1和COL4A1等膠原基因表達，從而具備抗纖維化功能[7]；有學者檢測到miR-21在腎纖維化患者腎組織中表達升高。雖已有多種miRNA與腎臟纖維化的密切關系被報道，但miR-219在腎臟纖維化中的作用及影響尚鮮有報道。本研究首先通過RT-qPCR檢測到腎纖維化患者血清中miR-219的表達水平明顯低于健康檢查者，并且在構建的UUO小鼠模型中也發(fā)現miR-219在腎臟組織內表達水平顯著降低，這表明miR-219可能與腎臟纖維化存在相關性。

在腎損傷時，AngII及其受體在成纖維細胞和系膜細胞中表達上調，刺激成纖維細胞增殖，促使ECM生成，促進TGF-β血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)等生長因子分泌而發(fā)揮促纖維化作用。腎損傷同時，α-SMA表達升高，標志著上皮細胞向肌成纖維細胞表型轉化，促使腎間質中肌成纖維細胞聚集，導致ECM合成和分泌增多，促進纖維化的形成。研究顯示，在體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中，α-SMA表達可被TGF-β1上調且腎小管上皮細胞表型轉化[3]。本研究采用AngII刺激NRK49F細胞后發(fā)現miR-219表達明顯降低，且Western blot結果顯示α-SMA蛋白表達升高；進一步用AngII刺激轉染了miR-219 mimics的NRK49F細胞，觀察到α-SMA蛋白表達水平明顯低于AngII刺激的NRK49F細胞，上述結果表明miR-219可抑制α-SMA的表達及AngII誘導的腎臟細胞纖維化，提示miR-219可能在腎臟纖維化的過程中發(fā)揮抑制作用。

TGFBR2是TGF-β II型受體編碼基因，其胞內含絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域，在肝臟和腎小球中密度最高。TGF-β必須通過與細胞膜上包括TGFBR2在內的特異性受體結合，才能發(fā)揮生物學作用。研究顯示，TGF-β是一種強烈的促纖維化因子，是促進腎纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵因子[8]，TGF-β1是TGF-β家族中最重要的成員之一，可促進腎小球硬化和腎間質纖維化。在纖維化進程中，TGF-β1可增加ECM的合成，上調纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor, PAI)和組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMPs)表達并減少基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)生成，抑制ECM降解，趨化并促進成纖維細胞增殖，刺激多種細胞因子合成和分泌，引起ECM過度沉積，并在腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉分化中發(fā)揮重要作用[9]。TGF-β信號轉導時，TGFBR2可以與TGF-β直接結合，TGFBR2自身磷酸化后被激活，與TGFBR1結合形成復合物并使TGFBR1的GS結構域磷酸化，激活TGFBR1；激活的受體復合物再通過Smads依賴性和MAPK等非Smads依賴性的途徑發(fā)揮其促纖維化作用。因此TGFBR2在TGF-β介導的信號轉導通路及促進腎臟纖維化中具有重要作用。研究發(fā)現，UUO誘導的腎臟纖維化中檢測到TGFBR1和TGFBR2增加[10]。miR-219可以抑制TGFBR2的表達并對TGF-β介導的信號通路造成干擾，從而抑制皮膚纖維化。

Figure 5.The mRNA levels of renal fibrosis factors were decreased in the NRK49F cells treated with miR-219. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖5miR-219抑制NRK49F細胞腎臟纖維化因子的mRNA表達

Figure 6.The renal fibrosis process was inhibited by miR-219 in the UUO mice. A: the morphology of renal fibrosis in UUO mice treated with miR-219 was detected by HE and Masson staining (×40); B: the mRNA level of fibrosis markers in the renal tissues of UUO mice treated with miR-219. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsUUO group.

圖6miR-219抑制UUO小鼠的纖維化進程

本研究通過miRNA靶基因數據庫預測TGFBR2是miR-219的潛在靶基因，并通過雙螢光素酶檢測發(fā)現miR-219可通過結合TGFBR2的3’-UTR進而抑制TGFBR2的表達。同時通過RT-qPCR和Western blot確定了miR-219可以抑制TGFBR2的mRNA和蛋白的表達水平，進一步驗證了miR-219對TGFBR2的靶向調控作用。

CTGF與腎臟、皮膚、肺和肝臟等多種組織器官纖維化的進程有關，在腎臟中含量最高。CTGF是TGF-β促纖維化信號通路的下游因子之一，刺激細胞增殖及ECM的形成，促進腎臟纖維化[11]。ECM的主要成分包括I型膠原和III型膠原，COL1A1和COL3A1分別是I型膠原和III型膠原的組成部分，與腎臟間質纖維化密切相關。本研究中我們發(fā)現NRK49F細胞轉染miR-219 mimics后，α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1這些腎臟纖維化相關因子mRNA的表達均顯著下降，這預示miR-219能夠通過抑制TGFBR2的表達，干擾TGF-β信號通路，從而抑制腎臟纖維化的發(fā)展。

本研究通過構建了UUO小鼠模型以進一步觀察miR-219對腎臟纖維化的影響。HE染色和Masson’s trichrome染色均顯示，UUO小鼠在注射miR-219后，纖維化進程明顯受到抑制。同時本研究還檢測到COL1A1和COL3A1的mRNA表達水平也明顯低于UUO小鼠。這些結果均表明miR-219可以抑制UUO小鼠腎臟纖維化的發(fā)展。

綜上所述，miR-219可抑制AngII誘導的腎臟細胞纖維化并下調腎臟纖維化因子α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1的表達，對UUO小鼠腎臟纖維化產生抑制效果。本研究結果顯示，miR-219可以結合TGFBR2的3’-UTR并抑制TGFBR2的表達，進而干擾TGF-β信號通路，抑制腎臟纖維化的發(fā)展。因此，miR-219可能成為腎臟纖維化診斷及治療的新靶點。