草坪基質(zhì)添加碳納米材料對高羊茅生長和蚯蚓生理的影響

王彥力，白 雪，多立安，趙樹蘭

（天津市動植物抗性重點實驗室，天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

碳納米材料（石墨烯、氧化石墨烯和碳納米管）由于其獨特的物理性質(zhì)，在高靈敏度傳感器制造、生物成像、藥物輸送和環(huán)境凈化領(lǐng)域顯示出巨大潛力[1]。石墨烯（G）是一種新興碳素材料，是由碳原子組成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜，也是目前已知的最薄、最堅硬、導電性最好的納米材料[2]。氧化石墨烯（GO）是重要的石墨烯衍生物之一，可作為新生代污水處理膜、新型吸附劑及監(jiān)測環(huán)境污染的電極材料，可以改變污染物的環(huán)境行為[3]。碳納米管（CNT）由于其穩(wěn)定性、較強的金屬性和導電性而廣泛用于航空航天、汽車和電子工業(yè)、生物醫(yī)學等領(lǐng)域[4]。然而，在大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用的同時，碳納米材料不可避免地被釋放到生態(tài)系統(tǒng)中，這無疑增加了其環(huán)境和生態(tài)風險。近年來，碳納米材料對不同生物的毒性效應(yīng)受到關(guān)注。Zhu等[5]研究表明，400 mg·L-1和600 mg·L-1氧化石墨烯暴露36 h后，顯著降低鹵蟲的孵化率，且幼蟲中丙二醛含量、總抗氧化能力、活性氧和超氧化物歧化酶活性均顯著增加。Myer等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，添加0.318 mg·g-1的碳納米管48 h后模糊網(wǎng)紋蚤的死亡率顯著降低。

高羊茅是禾本科多年生植物，作為我國北方廣泛應(yīng)用的草坪草之一，其具有很強的抗逆性，能夠耐寒、耐貧瘠，抗病能力強，在水土保持、城市綠化、草坪建植等方面發(fā)揮著巨大的作用[7]。蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)中生物量最大的無脊椎動物，在土壤結(jié)構(gòu)及肥力的形成和維持等諸多方面起著重要作用[8]。此外，蚯蚓在土壤中位于食物鏈的底端，能夠和土壤中的各類物質(zhì)直接接觸，對土壤環(huán)境中的外源物質(zhì)反應(yīng)敏感，存在于土壤中的各種污染物質(zhì)會對蚯蚓產(chǎn)生不同程度的影響[9]。赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）已經(jīng)被視為土壤生態(tài)毒理研究的主要模式生物。生物對環(huán)境脅迫的生物化學反應(yīng)被認為是環(huán)境污染的早期警告指數(shù)，許多酶活性已被認為是環(huán)境污染的生物標志物[10-11]。暴露于環(huán)境污染物的生物體中會產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（ROS），過量的ROS能氧化誘導破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，從而干擾細胞的正常功能[12]。為了抵抗氧化應(yīng)激，生物體內(nèi)具有與ROS相互作用的酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等。

有關(guān)碳納米材料對蚯蚓的毒性效應(yīng)已有一些報道，較多地集中于碳納米管及其在蚯蚓體內(nèi)的富集[13]。多壁碳納米管的急性毒性實驗顯示其對蚯蚓有輕微的毒性[14]；Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，改性納米碳黑對蚯蚓具有一定的毒性，可抑制蚯蚓抗氧化酶的活性。但有關(guān)石墨烯、氧化石墨烯和碳納米管在草坪建植體系中對蚯蚓的毒性研究未見報道。本研究選取具有代表性的高羊茅和赤子愛勝蚓為模式生物，石墨烯、氧化石墨烯和羧基化碳納米管為實驗材料，探究碳納米材料作為吸附劑施于草坪基質(zhì)中對高羊茅的生長、蚯蚓體內(nèi)酶活性和丙二醛（MDA）含量的影響，以了解不同新型碳納米吸附材料進行土壤修復(fù)的環(huán)境生態(tài)效應(yīng)，為早期診斷和評價環(huán)境中碳納米材料生態(tài)污染風險提供實驗方法和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤為天津師范大學校園土壤，其主要理化性質(zhì)：含水量16.2%，pH 7.12，電導率1950 –S·cm-1，有機質(zhì)、全氮和全磷含量分別為41.39、1.96、3.18 g·kg-1。草坪植物選用我國北方廣泛應(yīng)用的高羊茅（Festuca arundinacea）。生活垃圾堆肥來自天津小淀垃圾堆肥處理廠，基本性質(zhì)：pH 7.49，電導率2300–S·cm-1，有機質(zhì)、全氮和全磷含量分別為131.84、25.09、6.81 g·kg-1。石墨烯（G）微片由南京吉倉納米科技有限公司生產(chǎn)，為黑色無規(guī)則薄片，微片大小0.5～20 –m，比表面積40～60 m2·g-1；氧化石墨烯（GO）購自蘇州恒球石墨烯科技有限公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度3.4～7 nm，片層直徑10～50 –m，比表面積100～300 m2·g-1；羧基化碳納米管（CNT）購自北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑20～40 nm，長度10～30 –m，比表面積>110 m2·g-1。蚯蚓選用赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），實驗前先馴化7 d，環(huán)帶明顯的蚯蚓清腸24 h后，選擇體重300～500 mg的健壯成體放入不同處理進行培養(yǎng)，以牛糞為蚯蚓飼料。

1.2 實驗設(shè)計

采用塑料盆（高14 cm、內(nèi)徑18 cm），底部鋪墊尼龍網(wǎng)以防蚯蚓爬出。每盆裝校園土壤1000 g，3種碳納米材料均設(shè)定土壤質(zhì)量的1%和3%兩個比例，每盆添加35 g垃圾堆肥供植物生長所需。另外，每盆再添加150 g牛糞作為蚯蚓飼料。以不添加碳納米材料的處理為對照（CK），各處理設(shè)置3個平行。土壤與碳納米材料、堆肥、牛糞混勻后裝盆，每盆添加蚯蚓20條，播入草坪植物高羊茅種子3.5 g。塑料盆隨機排列，每5 d移動位置以保證光照一致，實驗期間溫度為25～34℃，相對濕度45%～65%，光照為自然入射光，培養(yǎng)期間按需補充水分。

1.3 指標測定

1.3.1 高羊茅地上生物量的測定

90 d后，將高羊茅齊地面刈割。先稱鮮質(zhì)量，然后置于烘箱85℃條件下烘干至恒質(zhì)量。

1.3.2 蚯蚓抗氧化酶、GST活性和MDA含量的測定

酶液制備過程如下：取清腸24 h后的蚯蚓洗凈吸干水分稱質(zhì)量，按照質(zhì)量體積比1∶10加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）迅速研磨，之后離心5 min（10 000 r·min-1，4 ℃），提取上清液。采用考馬斯亮藍染色法進行酶液中蛋白質(zhì)含量的測定，以牛血清白蛋白作為標準蛋白[16]。SOD活性采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定[17]，以抑制NBT光化學還原50%所需要的酶量為一個酶活單位。CAT的測定參照徐鏡波等[18]方法，25℃下，100 s內(nèi)使H2O2分解50%時的酶蛋白量為一個酶活單位。POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[19]，每分鐘內(nèi)470 nm下吸光值變化0.01為一個酶活單位。GST活性采用1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）比色法[20]，用分光光度計測定340 nm下1 min OD340的變化值；MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

采用SPSS 17.0軟件完成數(shù)據(jù)處理，利用Oneway ANOVA單因素方差分析進行差異顯著性分析（Duncan，P＜0.05），采用SigmaPlot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳納米材料對高羊茅株高和生物量的影響

草坪植物的地上生長直接關(guān)系到草坪的質(zhì)量和成坪效果，而株高和生物量是衡量高羊茅生長的重要指標。和CK相比，添加1%G使高羊茅株高增加3.4%，其余碳納米材料處理株高均出現(xiàn)了降低，但各處理之間差異不顯著（表1，P>0.05）。高羊茅地上鮮質(zhì)量和干質(zhì)量以1%的GO為最低，但各處理間也均無顯著性差異（P>0.05）。由此表明，碳納米材料對高羊茅的地上生長沒有顯著性影響。

2.2 碳納米材料對蚯蚓抗氧化酶活性的影響

SOD廣泛存在于各種動植物和微生物中，可以清除超氧化物自由基，是預(yù)防活性氧的第一道防線。由圖1可以看出，赤子愛勝蚓在含有1%和3%的碳納米材料土壤中暴露3個月后，體內(nèi)的SOD活性出現(xiàn)了顯著性抑制（P＜0.05），并隨添加比例的增大，抑制率增加。1%G、3%G、1%GO、3%GO、1%CNT和3%CNT處理SOD活性抑制率分別為24.5%、30.7%、35.2%、35.9%、30.4%和39.3%。其中，3%CNT對SOD活性抑制作用最大，抑制率達到39.3%。

表1 碳納米材料對高羊茅株高和生物量的影響Table 1 Effects of carbon nanomaterials on the plant height and biomass of Festuca arundinacea

CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以緩解污染脅迫下H2O2的毒害，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。如圖1所示，暴露于1%GO，蚯蚓體內(nèi)CAT活性略高于CK，但差異不顯著。其他碳納米材料處理，CAT活性被抑制，且隨添加比例的增大抑制作用加大。暴露于3%G和3%CNT時，CAT活性的抑制率分別為22.4%和21.7%，與CK組差異不顯著（P>0.05），但與1%GO相比，CAT活性顯著降低（P＜0.05）。

POD在細胞代謝過程中也可清除H2O2。從圖1可看出，赤子愛勝蚓暴露于碳納米材料90 d，體內(nèi)POD活性均出現(xiàn)了下降。3%GO處理組出現(xiàn)了顯著的抑制作用（P＜0.05），抑制率達到37.6%；其余處理組POD活性與CK組無顯著性差異（P>0.05）。

GST參與生物體的異物代謝，是一種重要的解毒酶。圖1顯示，1%G處理蚯蚓體內(nèi)GST活性（70.62 nmol·min-1·mg-1Pr）被激活，其他處理GST 活性有一定程度的降低，但和CK差異并不顯著（P>0.05）。可見，碳納米材料對GST活性無顯著影響。

2.3 碳納米材料對蚯蚓MDA含量的影響

脂質(zhì)過氧化是生物體中的有害過程，MDA含量可以反映細胞脂質(zhì)過氧化水平。碳納米材料對蚯蚓MDA含量的影響如圖2所示。與CK相比，各處理組中MDA含量有所波動，以3%GO處理的MDA含量（1.05 nmol·mg-1Pr）最高，但各處理和CK差異不顯著（P>0.05）。

圖1 碳納米材料對蚯蚓酶活性的影響Figure 1 Effects of carbon nanomaterials on the enzyme activities of earthworm

圖2 碳納米材料對蚯蚓MDA含量的影響Figure 2 Effects of carbon nanomaterials on the MDA content of earthworm

3 討論

已有研究表明，低濃度的碳納米材料對植物生長發(fā)育具有積極作用，主要表現(xiàn)在促進種子萌發(fā)、根系伸長和提高生物量的積累等[22]。在水培實驗中，多壁碳納米管能顯著增加植物種子的發(fā)芽率、根系和地上部的生長，和對照相比，大豆和大麥的發(fā)芽率提高50%，玉米提高90%[23]。也有研究表明，在一定的實驗條件下，碳納米材料對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生負面影響，如生長抑制、生物量下降、活性氧含量增加等[2]。碳納米材料對植物的影響可能與其作用方式和吸收途徑、對植物基因表達和根際微生物的影響有關(guān)[2]，但具體的作用機理還不清楚，有待于進一步深入研究。本研究結(jié)果顯示，1%和3%碳納米材料未對高羊茅的株高、地上干質(zhì)量和鮮質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響，表明高羊茅對碳納米材料具有一定的耐受性。

抗氧化酶（SOD、CAT、POD）被認為是保護生物大分子免受氧化損傷的主要防御系統(tǒng)，可以協(xié)同清除其體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，從而保護細胞免遭破壞[24]。蚯蚓體內(nèi)各種酶活性及MDA含量對碳納米材料響應(yīng)特征不同。土壤中添加碳納米材料使得SOD活性顯著降低，而CK組中SOD活性處于較高水平，表明SOD活性受到抑制。通常情況下，當蚯蚓受到輕度污染脅迫時，SOD活性被誘導，當受到重度逆境脅迫時，SOD活性會降低[25]。在碳納米材料脅迫下，蚯蚓的代謝平衡受到破壞，引起代謝產(chǎn)物活性氧的積累。SOD活性的降低可能是由于清除過多的氧自由基而導致酶失活[26]。碳納米材料含量越高，蚯蚓體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基數(shù)量越多，且3%CNT引起的損傷更大，SOD活性受抑制更顯著。Zhao等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)，改性納米碳黑均顯著降低了蚯蚓的SOD活性，這與本實驗的結(jié)果相一致。

在活性氧轉(zhuǎn)化過程中，產(chǎn)生的H2O2對細胞也有一定的毒害作用，CAT可以將其分解，使細胞免受毒害[27]。本實驗中，3%CNT和3%G顯著抑制CAT活性，這可能與納米材料本身的性質(zhì)、濃度大小和持續(xù)時間有關(guān)。高含量的碳納米材料處理下CAT活性降低，可能是自由基導致的酶失活，或與合成相關(guān)酶的蛋白質(zhì)減少或受損有關(guān)；其活性的抑制將導致H2O2的累積，有可能對蚯蚓造成過氧化損傷[28]。

POD與CAT對于清除生物體內(nèi)過量的H2O2具有很好的協(xié)同作用，二者在細胞中存在的位置不同，而使其分工存在差異[29]。添加碳納米材料后POD活性降低，其中3%GO抑制作用最顯著，這可能與碳納米材料本身的尺寸、層數(shù)、團聚狀態(tài)、結(jié)構(gòu)缺陷、氧化程度等性質(zhì)有關(guān)[30]?？傮w來說，添加碳納米材料后，蚯蚓體內(nèi)SOD、POD和CAT活性出現(xiàn)了降低，SOD對碳納米材料的敏感性大于CAT和POD。

GST作為第二階段解毒酶，可催化污染物與GSH結(jié)合，生成極性的小分子物質(zhì)，從而減輕其毒性[31]。而碳納米材料并未引起GST活性的顯著變化，這可能是因為其毒性未超過蚯蚓的耐受范圍，GST未發(fā)揮作用。MDA是細胞脂質(zhì)在受活性氧脅迫后而形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它反映了蚯蚓機體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)和活性氧間的平衡，進一步間接反映了蚯蚓對外源干擾的適應(yīng)能力[32]。MDA含量各處理與CK無明顯差異，說明蚯蚓體內(nèi)可以通過抗氧化酶的調(diào)節(jié)，緩解脂質(zhì)過氧化，使機體處于平衡狀態(tài)。

4 結(jié)論

（1）草坪基質(zhì)中添加一定比例的碳納米材料未對高羊茅產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)，高羊茅對碳納米材料的耐受性較好，抗逆性強。

（2）蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活性對碳納米材料的響應(yīng)總體上表現(xiàn)為下降，表明碳納米材料能引起蚯蚓體內(nèi)的毒性效應(yīng)，抑制抗氧化酶的活性。其中SOD活性均顯著低于CK，因此在蚯蚓抗氧化酶中可以選取SOD作為碳納米材料污染程度的指示指標。

（3）碳納米材料對蚯蚓體內(nèi)的GST酶活和MDA含量無明顯影響，蚯蚓可能通過抗氧化防御系統(tǒng)或其他機制進行自我修復(fù)，減輕毒害作用。