微塑料對小麥種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

連加攀，沈玫玫，劉維濤

（南開大學環(huán)境科學與工程學院環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室/天津市城市生態(tài)環(huán)境修復與污染防治重點實驗室，天津300350）

微塑料（Microplastic）是一類新型的全球性環(huán)境污染物，近十幾年來已引起了國內(nèi)外環(huán)境學者的高度關注[1-2]。微塑料的概念最早由英國學者Thompson等[3]在2004年提出，目前學術界對微塑料定義中粒徑大小仍存在一定爭議，但通常將微塑料分類為粒徑小于5 mm的塑料[3-5]。根據(jù)其來源分類，環(huán)境中微塑料又可分為初生微塑料和次生微塑料[6]。初生微塑料是現(xiàn)實中為多種用途而制造的塑料微粒，它們均可以被直接排放進入環(huán)境中，例如工業(yè)磨料或者化妝品中的塑料微珠[7-8]。而次生微塑料則是由大尺寸的塑料在環(huán)境中風化（如水解、紫外光降解、機械磨損、生物降解）降解形成，如洗滌過程中產(chǎn)生的二次塑料纖維[9-10]。環(huán)境中的微塑料粒徑小、數(shù)量大、分布廣且可作為污染物載體，易被生物所攝食并且能在食物鏈中積累，從而可能會對人體健康和生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生潛在的不利影響[6，8，11]。

目前，微塑料的研究主要集中在海洋、河流和湖泊等水域環(huán)境[3，9，12-14]，有關微塑料對陸地生態(tài)系統(tǒng)尤其是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)影響的研究相對缺乏[1]。據(jù)報道，由于含微塑料有機廢物的循環(huán)利用及塑料薄膜的大量使用，農(nóng)業(yè)土壤中積累的微塑料含量實際上比海洋更多[2，15]。Ng等[16]利用現(xiàn)有的法規(guī)估算了歐洲、北美和澳大利亞農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中微塑料的最大負荷，發(fā)現(xiàn)僅來自有機廢物循環(huán)利用的微塑料負荷就高達2.8～63 t·hm-2。Zhang等[17]調(diào)查我國西南地區(qū)土壤團聚體中微塑料分布發(fā)現(xiàn)土壤中微塑料的平均豐度為18 760個·kg-1，其中＜1 mm的微塑料豐度最高；蔬菜土壤中的微塑料含量比緩沖區(qū)土壤高，可能是由于土壤添加劑的長期使用和污水灌溉所導致。已有研究表明，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的微塑料不僅能降低土壤微生物量、微生物活性和功能多樣性，還會影響土壤中植物營養(yǎng)元素的循環(huán)過程[2，18]，從而可能會間接影響植物種子發(fā)芽及幼苗的生長。

值得關注的是，農(nóng)作物作為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，農(nóng)作物的生長不可避免地會受到土壤環(huán)境中諸多因素（包括微塑料）的影響，而有關微塑料對農(nóng)作物種子發(fā)芽和幼苗生長等的研究迄今尚未見報道。因此，本文采用糧食作物小麥（Triticum aestivumL.）作為供試植物，以3種農(nóng)業(yè)環(huán)境中常見乙烯-乙酸乙烯酯共聚合物（EVA）、線性低密度聚乙烯（LLDPE）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微塑料為研究對象，研究了這3種微塑料在不同濃度下對小麥種子發(fā)芽和幼苗生長的影響，旨在探討微塑料對農(nóng)作物的生態(tài)效應，為后期評估微塑料對作物的生態(tài)毒理效應提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥種子為西北農(nóng)林科技大學選育的小偃22號（國審麥2003034，實測發(fā)芽率為97.5%）。供試試劑為：吐溫20（Tween 20），過氧化氫（H2O230%）分析純。微塑料粉末（產(chǎn)品均標注為50 nm）分別購自廣州大韓油化（型號KP3755）和上海悅晨塑料有限公司。

1.1.1 微塑料表征

微塑料的成分和形貌的鑒定采用傅立葉紅外光譜儀（FT-IR，Thermo-Nicolet iS50）和場發(fā)射掃描電鏡（SEM，JSM-7800）。傅立葉紅外光譜儀：將微塑料粉末與提前烘干的溴化鉀混合后充分研磨，然后裝入樣品池，對其在650～4000 cm-1范圍內(nèi)進行傅立葉紅外光譜測定并與數(shù)據(jù)庫（HR Nicolet Sample Library）信息進行樣品分析比對。場發(fā)射掃描電鏡：取少量微塑料粉末樣品放在粘上雙面膠帶載物盤圓心位置，然后用橡膠球朝載物盤徑外方向輕吹使其均勻分布，再在膠帶邊緣涂上導電銀漿以連接樣品和載物盤，待其干燥后直接進行噴金處理，在不同分辨率下拍攝清晰的掃描電鏡照片。

1.1.2 微塑料濃度設置和懸浮液的制備

參考Zhu等[19]和Murphy等[20]實驗中微塑料濃度設置，本實驗選0、0.001%、0.01%、0.05%和0.1%（m/m）5個濃度水平。具體步驟為稱取0、2、20、100 mg和200 mg微塑料粉末加入200 mL高純水中，再加入0.1% 吐溫20（Tween 20），經(jīng)超聲波粉碎機（新芝JY98-ⅢN）在水浴條件下超聲30 min（400 W、20.5 kHz）使其均勻分散形成 0、10、100、500、1000 mg·L-1的微塑料懸浮液，并測定懸浮液中微塑料的粒徑分布及Zeta電位（Zetasizer Nano ZS 90）。

1.2 種子發(fā)芽實驗

在玻璃培養(yǎng)皿中墊放兩張定性濾紙，并用去離子水潤濕，趕走濾紙下方遺留的氣泡。將籽粒均勻飽滿的小麥種子用3%（V/V）H2O2消毒30 min，再用去離子水反復沖洗后，整齊擺放在提前準備好的培養(yǎng)皿中，每皿10粒并設4個重復，然后加入10 mL濃度為0、10、100、500、1000 mg·L-1的微塑料懸浮液。對照組用只含0.1%Tween 20去離子水培養(yǎng)。將處理好的培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱（SPX-330I-C型）中在黑暗條件下進行發(fā)芽實驗，溫度控制在25±1℃，培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)過程中每天記錄小麥種子萌發(fā)情況，從第3 d開始打開培養(yǎng)皿并補充1～2 mL去離子水以補償蒸發(fā)水分。

1.3 測定方法

待第7 d收獲后，用游標卡尺測定芽長、根長，并將小麥幼苗置于103℃烘箱中烘干24 h至恒質量，用天平稱量記錄。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間和抑制率等指標的計算公式如下：

發(fā)芽率（GR）=（7 d內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽勢（GV）=（3 d內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑Gt/Dt

式中：Gt為t天內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；Dt為對應的發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)（VI）=發(fā)芽指數(shù)×苗干質量

平均發(fā)芽時間（MGT）=∑（F·X）/∑F

式中：F是種子在第X天的新發(fā)芽數(shù)；X是發(fā)芽天數(shù)。

抑制率=（對照-處理）/處理×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結果均以平均值±標準偏差（Mean±SD）表示，采用Excel 2003對數(shù)據(jù)進行處理，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并由Origin 2017和ImageJ軟件進行繪圖和圖片信息處理。

2 結果與分析

2.1 微塑料的組成與形貌

本實驗所用的微塑料的成分與形貌鑒定結果見圖1。經(jīng)過傅立葉紅外光譜分析（圖1上），3種微塑料對比度分別是EVA 61.71%、LLDPE 70.70%和PMMA 54.91%。塑料中的添加劑或者加入其他塑料來改性以達到實際需要性能都是導致其對比度下降的原因。其中，EVA膜被廣泛應用于農(nóng)業(yè)大棚膜，為具有良好的透明性和保溫耐寒防老化性能，常在EVA膜中添加流滴劑、消霧劑和耐老化劑等添加劑。LLDPE是聚乙烯（PE）中的一種，具有防潮性、透濕性小，常作為農(nóng)業(yè)地面覆蓋薄膜以提高土壤溫度，保持土壤水分，促進植物生長。PMMA透光率高、隔熱性好、耐候性好，利于作物的發(fā)育，被廣泛用作農(nóng)林溫室材料。

從掃描電鏡圖可以看出，3種微塑料均為不規(guī)則的球形顆粒（圖1中）。與EVA和PMMA相比，LLDPE中含有少量的不規(guī)則的塊狀或者桿狀的微塑料碎片。通過對3種微塑料粒徑分布測定發(fā)現(xiàn)，LLDPE和PMMA粒徑分布大致符合正態(tài)分布，其平均粒徑分別為11.3 μm和1.4 μm；而EVA粒徑分布集中在1.5 μm內(nèi)（占74.6%），其表觀平均粒徑為2.5 μm。

2.2 懸浮液中微塑料的粒徑及Zeta電位

微塑料在懸浮液中的粒徑分布及Zeta電位測定結果如表1所示。微塑料在懸浮液中帶負電荷。當EVA濃度高于100 mg·L-1和LLDPE濃度為1000 mg·L-1時，Zeta電位絕對值均低于30 mV，表明這兩種懸浮液隨濃度的升高而穩(wěn)定性降低，在高濃度容易發(fā)生顆粒的團聚。值得注意的是，PMMA的Zeta電位絕對值一直高于40 mV，反映此懸浮液具有良好的穩(wěn)定性。粒徑測定結果表明，微塑料在溶液中的粒徑均隨著濃度升高而增加，均發(fā)生一定的團聚。另外，溶液中微塑料的粒徑大小順序為：d（EVA）＜d（PMMA）＜d（LLPDE）。

2.3 微塑料對小麥種子發(fā)芽率的影響

發(fā)芽率是衡量種子在微塑料暴露下萌發(fā)能力強弱的重要指標。小麥種子在微塑料暴露下的發(fā)芽率為69%～97.5%（圖2），表明在微塑料暴露脅迫下，大部分小麥種子能夠萌發(fā)。值得注意的是，微塑料在低中濃度（＜500 mg·L-1）時對小麥的發(fā)芽有抑制，抑制率在2.86%～20%；但在高濃度（1000 mg·L-1）時卻表現(xiàn)出一定的促進作用（圖2D），表現(xiàn)出一定的“高促低抑”現(xiàn)象。其中，LLDPE和EVA濃度為500 mg·L-1時，小麥的發(fā)芽抑制作用最強；而PMMA在濃度為100 mg·L-1時，小麥發(fā)芽率最低（76.7%）（圖2），抑制率達到16.1%。

2.4 微塑料對小麥種子生長特性的影響

微塑料處理對小麥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)基本表現(xiàn)為“低促中抑高恢復”的規(guī)律，即低濃度（10 mg·L-1和100 mg·L-1）促進，中濃度（500 mg·L-1）抑制，高濃度（1000 mg·L-1）抑制有所恢復，與對照組（CK）相比差異不顯著（P>0.05）（表2）。具體表現(xiàn)為：在微塑料的暴露濃度為10 mg·L-1時，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均為最高，而在暴露濃度為500 mg·L-1時發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最低，在高濃度（1000 mg·L-1）微塑料處理時，種子發(fā)芽勢相對于中濃度（500 mg·L-1）有所升高，表現(xiàn)出一定的恢復現(xiàn)象。對于活力指數(shù)，3種微塑料的影響各不相同（表2）。與對照組（CK）相比，EVA和PMMA對小麥種子活力指數(shù)無明顯變化。但與EVA相比，PMMA對活力指數(shù)的促進更加顯著；而LLDPE在10 mg·L-1和100 mg·L-1均對小麥種子活力指數(shù)有所抑制。綜合分析，3種微塑料對小麥種子活力指數(shù)抑制程度為：LLDPE>EVA>PMMA。

圖1 微塑料的紅外吸收光譜圖（上）、掃描電鏡圖（中）和粒徑分布圖（下）Figure 1 Infrared absorption spectrum（top），scanning electron micrograph（middle）and particle size distribution of three microplastics（bottom）

表1 懸浮液中微塑料的粒度分布和Zeta電位Table 1 Particle size distribution and Zeta potential of microplastics in suspension

種子平均發(fā)芽時間是發(fā)芽速度的量度，其數(shù)值越低表明發(fā)芽越快。表2顯示微塑料的種類和濃度對小麥種子平均發(fā)芽時間的影響存在差異。EVA對小麥種子平均發(fā)芽時間的影響與其濃度密切相關。當濃度為10 mg·L-1時，EVA能明顯縮短種子平均發(fā)芽時間（P＜0.05），但在1000 mg·L-1時能延長種子平均發(fā)芽時間，且此兩個濃度達到極顯著差異（P＜0.01）。與對照組相比，PMMA對小麥種子平均發(fā)芽時間無明顯影響，而LLDPE在100 mg·L-1時顯著縮短小麥種子平均發(fā)芽時間（P＜0.05）。

圖2 在微塑料暴露下小麥種子發(fā)芽率（A、B、C）和抑制率（D）隨時間的變化Figure 2 Changes in germination percentage（A，B，C）and germination inhibition rate（D）of wheat seed with time under microplastics exposure

表2 微塑料對小麥種子生長特征的影響Table 2 Influence of microplastics on growth features of wheat seedling

2.5 微塑料對小麥芽長、根長和幼苗生物量的影響

小麥幼苗的芽長和苗長均呈現(xiàn)隨EVA和LLDPE濃度先升高后下降的趨勢（圖3和圖4）。在EVA和PMMA暴露下，小麥芽長和苗長與對照組相比并沒有明顯變化；而在LLDPE暴露時，10 mg·L-1處理下的芽長與對照組達到統(tǒng)計學差異（P＜0.05），說明低濃度的LLDPE暴露能抑制小麥幼苗地上部的生長（圖3和圖4）。而在LLDPE 100 mg·L-1時，芽長和苗長雖然比對照組分別增加了18.5%和17.3%，但統(tǒng)計學差異并不明顯。與EVA和LLDPE不同的是，PMMA處理后的小麥苗長與濃度呈顯著負相關（r=-0.513，P＜0.05），即小麥苗長與PMMA濃度梯度相關。

微塑料暴露下的小麥幼苗根長均與對照組無顯著差異（P>0.05）（圖4C），表明微塑料對小麥幼苗的根伸長影響較小?？偟膩砜?，微塑料濃度為500 mg·L-1時對小麥幼苗根伸長具有一定的促進作用，而濃度為1000 mg·L-1時則表現(xiàn)出抑制作用。其中，PMMA對小麥幼苗根長的抑制率比EVA和LLDPE更高（1.47%～23.21%），LLDPE僅在濃度為10 mg·L-1時對小麥根長表現(xiàn)出抑制作用。與微塑料對小麥根長的影響類似，相較于對照組，小麥生物量（干質量）在微塑料暴露下的變化也不顯著（P>0.05）（圖4 D），表明微塑料對小麥干質量影響不大。但值得注意的是，低濃度（10 mg·L-1）PMMA暴露下，小麥幼苗的干質量最大，其干質量隨著PMMA濃度的增加而降低；EVA和LLDPE的濃度為100 mg·L-1時，小麥幼苗的干質量最大。

3 討論

目前有關微塑料的研究主要集中在海洋、河口和湖泊等水域生態(tài)系統(tǒng)中的污染現(xiàn)狀[21-25]，以及微塑料對藻類[26]、貽貝[27]、魚類[28]和蝦類[29]等水生生物的毒理學效應及其食物鏈傳遞[30]，而有關微塑料對陸生植物毒性的研究未見報道，因此無法與本實驗的研究結果進行對比。

農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中微塑料的來源已有研究，但尚缺乏更為詳細和量化的數(shù)據(jù)。微塑料一旦進入農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)[31]，會持續(xù)存在、積累，并最終達到能夠影響農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性和功能的水平，所以對應用于農(nóng)業(yè)領域中的塑料進行系統(tǒng)的檢測和量化顯得極為重要[2，32]。但目前有關微塑料檢測和鑒定的方法仍需要進一步優(yōu)化。目前對微塑料的鑒定分析普遍采用光譜分析[傅立葉（變換）紅外光譜、拉曼光譜等][33]，本實驗所用的微塑料與數(shù)據(jù)庫標準譜線對比度不高（54.91%～70.70%），則反映了應用于農(nóng)業(yè)中微塑料的復雜性。實際應用的塑料絕大多數(shù)為追求優(yōu)良性能而進行過改良，除了上述的添加劑（流滴劑、消霧劑和耐老化劑等）外，塑料之間的摻雜也是重要的因素。此外，環(huán)境介質樣品中微塑料的分類和分離主要還是依靠人眼和顯微鏡的輔助，而生物樣品中的微塑料的識別和鑒定具有一定的挑戰(zhàn)性，特別是粒徑小于1 mm的微塑料，因此仍需要微塑料分離檢測技術的創(chuàng)新[34]。

圖3 微塑料對小麥幼苗生長的影響Figure 3 Effect of microplastics on growth of wheat seedlings

圖4 微塑料對小麥芽長、根長和生物量的影響Figure 4 Effect of microplastics on coleoptile length，root length and biomass of wheat seedlings

目前有關農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中微塑料與作物相互作用的研究極為缺乏，微塑料對植物的作用機理并不清楚[2，16]。本研究發(fā)現(xiàn)三種微塑料在中低濃度下對小麥種子發(fā)芽有抑制作用，但在高濃度時對小麥發(fā)芽具有一定的恢復或者促進作用，其原因可能是小麥種子對微塑料的吸附和吸收取決于微塑料本身所帶的電荷和粒徑[15，35]。低中濃度下微塑料的粒徑可能對小麥的影響占主導地位，雖然其Zeta電位更低（表1），但更小的粒徑可能更加利于小麥對微塑料的吸附和吸收。相反地，高濃度的微塑料對小麥發(fā)芽率的恢復或者促進是由微塑料的團聚而引起的[15，29]，團聚后的微塑料粒徑成為吸附的重要阻礙因素，降低了小麥對微塑料的可接觸性，從而減輕了其發(fā)芽脅迫。而相比對照組而言，3種微塑料對小麥苗長、根長和生物量并無顯著影響，表明微塑料對小麥的生長發(fā)育毒性不大。而僅LLDPE在10 mg·L-1時對小麥活力指數(shù)和芽長有抑制，可能是在低濃度下，小麥芽長對粒徑最小的 LLDPE 更加敏感。類似地，Kalˇcíková等[36]發(fā)現(xiàn)化妝品中的微塑料對浮萍的平均葉片生長速率和葉綠素含量均沒有影響，但只有銳狀微塑料能通過機械損傷顯著降低其根長和根細胞活力。

微塑料中的增塑劑以及微塑料對環(huán)境污染物的吸附作用也是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)需要重點關注的問題。塑料合成中添加的增塑劑也會隨著塑料的自然風化而釋放到環(huán)境中，對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構成影響[15，37-40]。其中研究和報道最多的增塑劑是鄰苯二甲酸酯類（PAEs），其屬于一種塑料軟化劑，具有致癌性，能干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)。研究表明，PVC農(nóng)膜中的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）能在弱酸性條件下大量析出[41]，對植物產(chǎn)生潛在的毒理學效應。劉曉丹等[42]發(fā)現(xiàn)塑料中的增塑劑能夠抑制小麥種子的萌發(fā)，甚至在高濃度下能引發(fā)小麥種子細胞的程序性死亡。此外，環(huán)境中風化成的微塑料表面粗糙，且具有較大的比表面積、帶負電荷，能吸附重金屬和有機污染物[43-45]，從而成為污染物的環(huán)境載體，加劇微塑料對植物的毒害效應，因此農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的微塑料與重金屬或農(nóng)藥的聯(lián)合效應還有待進一步研究。

綜上所述，今后關于微塑料與農(nóng)作物間的交互作用研究亟需深入開展：（1）微塑料在農(nóng)田土壤中的污染現(xiàn)狀及其來源；（2）適用于環(huán)境生物樣品中微塑料的分離和檢測技術；（3）微塑料與重金屬、有機污染吸附后對植物的毒性效應。

4 結論

（1）在微塑料暴露下，小麥種子的發(fā)芽率為69%～97.5%。微塑料對小麥種子發(fā)芽表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制率在2.86%～20%。

（2）微塑料處理對小麥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響表現(xiàn)為低濃度（10 mg·L-1和100 mg·L-1）促進，中濃度（500 mg·L-1）抑制，高濃度（1000 mg·L-1）抑制作用有所降低，與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

（3）與對照組相比，微塑料對小麥苗長、根長和干質量沒有顯著影響（P>0.05），僅在LLDPE為10 mg·L-1處理時對小麥芽長產(chǎn)生明顯抑制作用。