新型DNA-AgNCs在谷胱甘肽臨床體外診斷中的應(yīng)用研究

夏海娜 邵偉

【摘要】 目的：以DNA為模板制備的水溶性銀納米簇（AgNCs）具有合成簡單性質(zhì)溫和的特點，為拓展其在臨床體外診斷中的應(yīng)用，開展本次研究。方法：從四種緩沖液和三種DNA合成模板中篩選出最佳合成方案，制備具有良好熒光特性的DNA-AgNCs，并利用其對GSH和GGSH進行快速靈敏的體外檢測，驗證其在體外診斷中所發(fā)揮的作用。結(jié)果：合成的DNA-AgNCs熒光特性穩(wěn)定，熒光光譜性質(zhì)穩(wěn)定，對GSH的檢測具有很強的特異性，在0～10 μmol/L的范圍內(nèi)DNA-AgNCs的熒光強度與GSH的濃度成反比。結(jié)論：本研究為DNA-AgNCs在體外診斷中的應(yīng)用帶來了新的思路，拓展了其應(yīng)用領(lǐng)域，其優(yōu)異的熒光特性具有廣闊的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】 銀納米簇 DNA 體外診斷熒光

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.28.028 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）28-00-03

Application of Novel DNA-AgNCs in the Clinical Diagnosis of Glutathione in Vitro/XIA Haina， SHAO Wei. //Chinese and Foreign Medical Research， 2019， 17（28）： -70

[Abstract] Objective： To explore the role that AgNCs can play in clinical in vitro diagnosis， and show the characteristics of simple synthesis and mildness that water-solubled silver nanoclusters （AgNCs） prepared by DNA template had， we conducted this study. Method： Selected the best synthesis scheme from four buffer solutions and three DNA synthesis templates， prepared DNA-AgNCs with good fluorescence characteristics， and used it for rapid and sensitive in vitro detection of GSH and GGSH to verify its role in vitro diagnosis. Result： The DNA-AgNCs had stable fluorescence characteristics and stable fluorescence spectra. The detection of GSH was highly specific， and the fluorescence intensity of DNA-AgNCs was inversely proportional to the concentration of GSH in the range of 0-10 μmol/L. Conclusion： Our study provides a new idea for the application of DNA-AgNCs in vitro diagnosis， expanded its application field， and its excellent fluorescence characteristics have broad application prospects.

[Key words] AgNCs DNA IVD Fluorescence

First-authors address： Putuo District Peoples Hospital in Zhoushan City， Zhoushan 316100， China

銀納米簇（sliver nanoclusters，AgNCs）是由幾個到十幾個銀原子組成的納米分子級聚集體，其往往是由有機配體或生物相容性材料作為穩(wěn)定基團包裹形成的[1-2]。AgNCs與其他熒光金屬納米簇的一樣，具有熒光強度高、抗光漂白性強、量子產(chǎn)率高、熒光波長可調(diào)[3]、生物毒性低等優(yōu)點[4]，近年來在生物檢測[5]、體外診斷、熒光示蹤和細胞成像分析等領(lǐng)域受到了越來越廣泛的關(guān)注[6]。谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的具有重要生理功能的天然活性肽，在體內(nèi)有還原型和氧化性兩種形態(tài)。還原型谷胱甘肽（glutathione reduced，GSH），具有清除自由基、解毒、保護肝臟、提高免疫力及抗癌等諸多作用，其半胱氨酸上的巰基是發(fā)揮其生物學功能所不可缺少的功能基團。谷胱甘肽的檢測可以為病毒性肝炎、腦類疾病、免疫系統(tǒng)疾病等的診斷提供依據(jù)[7]。本研究首先探索了AgNCs的合成，由于溫和地制備水溶性AgNCs并不容易，筆者選擇以DNA為合成模板，并篩選了最佳的性質(zhì)溫和的緩沖體系，研究合成后的DNA-AgNCs作為體外診斷試劑在檢測GSH中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料

（1）硝酸銀（AgNO3）（購于Sigma公司）;（2）醋酸銨（CH3COONH4，NH4Ac）（購于Sigma公司）;（3）脫氧核糖核酸（DNA）模板鏈（購于Sangon上海分公司，經(jīng)PAGE純化），DNA1：5-TTCCCACCCACCCCGGCCCGTT-3;DNA2：5-TATCCGTCCCCCACGGATA-3;DNA3：5-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3;（4）硼氫化鈉（NaBH）（購于aladdin公司）;（5）磷酸二氫鈉（NaH2PO4）（購于Sigma公司）;（6）磷酸二氫鉀（KH2PO4）（購于Sigma公司）;（7）磷酸氫二鈉（Na2HPO4）（購于Sigma公司）;（8）氯化鉀（KCl）（購于Sigma公司）;（9）氯化鈉（NaCl）（購于Sigma公司）;（10）GSH（購于Sigma公司）;（11）氧化型谷胱甘肽（Glutathione oxidized，GSSG）（購于Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA-AgNCs的合成 4個不同的DNA合成組（1～4號分別為H2O對照組、DNA1模板組、DNA2模板組、DNA3模板組）分別加入H2O、PBS、低濃度NH4Ac（10 mmol/L NH4Ac）、高濃度NH4Ac（80 mmol/L NH4Ac）四種不同的緩沖體系中，再向體系中加入AgNO3溶液，三者充分混勻后放置于4 ℃冰箱中孵育20 min。隨后向反應(yīng)體系中加入NaBH4混勻，放置于4 ℃冰箱中反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后取樣品測定其熒光強度，剩余樣品在凝膠成像儀中拍照，隨后放入冰箱中保存。

1.2.2 熒光檢測方法 實驗中，銀納米簇的熒光光譜用F7000熒光光譜儀檢測，光譜儀的檢測參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)光波長570 nm，激發(fā)光光柵為2.5 nm，發(fā)射光范圍580～800 nm，發(fā)射光接收光柵為2.5 nm，激發(fā)光電壓為900 V。

1.2.3 GSH的檢測 取DNA-AgNCs與不同濃度的GSH和GSSG水溶液等體積混合，混勻后將反應(yīng)體系避光靜置5 min，測定其熒光光譜。

2 結(jié)果

本研究選擇了一種耗時較短的合成方法，按緩沖體系的不同分為四組，通過凝膠成像儀拍攝的結(jié)果圖1中可以看出，在10 mmol/L NH4Ac（圖1A）、H2O（圖1B）、pH 7.0 10 mmol/L PBS（圖1C）、80 mmol/L NH4Ac（圖1D）四種緩沖體系中，1～4號EP管中分別加入H2O（對照）及DNA1、DNA2、DNA3三種合成模板，在四組中均都只有加入DNA1的2號管中合成了具有熒光特性的DNA-AgNCs，因此，DNA1是研究所選的合成條件下，最佳的合成模板。

從圖1中還可以看出，在不同緩沖條件下，合成產(chǎn)物的熒光強度（亮度）有明顯的不同，B、C兩組熒光強度明顯弱于A、D兩組，但是較難區(qū)別A、D兩組合成產(chǎn)物的熒光強度差異，因此研究選擇通過熒光光譜檢測區(qū)分二者的差異。最終結(jié)果顯示A組緩沖體系合成的DNA-AgNCs熒光強度更高，最佳合成方案為在10 mmol/L NH4Ac中利用DNA1為模板合成DNA-AgNCs。

通過一系列驗證，最終選擇A組緩沖中，利用DNA2為模板合成DNA-AgNCs，并且在合成后，用熒光光譜儀對其熒光特性做了熒光光譜表征，合成的DNA-AgNCs激發(fā)光波長為570 nm，發(fā)射光波長為630 nm。峰值不會隨激發(fā)光的改變而偏移，合成產(chǎn)物熒光強度穩(wěn)定，熒光效率強（圖2）。

本研究隨后利用合成的DNA-AgNCs對GSH進行了檢測，因為GSH和GSSG在人體中是共同存在的，因此檢測體系需要對二者進行區(qū)別（圖3），從圖中可以看出在0～10 μmol/L時GSSG對DNA-AgNCs的熒光強度幾乎沒有影響，GSH在人體血液中的含量約為371 mg/L，GSSG約為3.71 mg/L（約為6.05 μmol/L），通過圖3的結(jié)果可以看出，在對實際樣本檢測時GSSG的存在不會對GSH的檢測產(chǎn)生影響，因此，利用合成的DNA-AgNCs對GSH的檢測是具有特異性的。

3 討論

光學納米探針在疾病治療、生物學成像、光學示蹤和體外診斷等方面現(xiàn)在發(fā)揮了越來越大的作用[8-9]，金屬熒光納米簇由于具有特殊的光電學性質(zhì)，近年來在體外診斷和影像學分析領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注和研究，金銀納米簇是金屬納米簇中獲得最多關(guān)注的研究對象。相比于金納米簇，銀納米簇的應(yīng)用研究，尚處于開始階段，由于其具有合成簡單、熒光量子產(chǎn)率高、熒光發(fā)射波長可調(diào)等優(yōu)點，已經(jīng)成為金屬熒光納米簇領(lǐng)域里具有良好發(fā)展前景的材料之一，在體外診斷、檢測分析、熒光成像和示蹤、生物標記等應(yīng)用領(lǐng)域被廣泛研究。

與金納米簇相比，在性質(zhì)溫和的水溶液中合成具有穩(wěn)定熒光性質(zhì)的銀納米簇相對要困難得多，這是由于在水溶液中AgNCs、自身趨向于團聚，使得新合成的AgNCs的體積會持續(xù)增長，從而變成大尺寸的納米顆粒，喪失熒光特性。因此，在AgNCs合成中，需要降低表面能量，阻止其持續(xù)性增長，就需要選擇與Ag/Ag+親和力強的模板或抑制劑來合成，目前常用的模板分子有很多，比如，聚合物（聚乙烯亞胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚酰胺-胺樹狀分子等）、DNA、多肽和蛋白等[10]。從2004年P(guān)etty等[11]首次以DNA為模板制備了穩(wěn)定性好、可溶于水的、熒光性質(zhì)穩(wěn)定的AgNCs，此后，越來越多文獻報道DNA-AgNCs的合成及其應(yīng)用。由于DNA模板可以靈活設(shè)計，合成簡單快速，逐漸成為最受歡迎的AgNCs合成模板，隨著研究工作的不斷展開，研究人員發(fā)現(xiàn)DNA模板的長度和序列能夠調(diào)控合成后的DNA-AgNCs的光學性質(zhì)，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的光學差異，發(fā)射不同波長的熒光[12]。

目前，DNA-AgNCs主要在疾病標志物診斷和熒光顯影中進行應(yīng)用研究，其中絕大部分都是利用其熒光的淬滅或增強檢測離子等小分子、利用DNA的堿基互補配對特性來檢測特定的DNA序列/單堿基突變或與DNA有關(guān)酶類的檢測[13-15]。

本研究利用合成的新型DNA-AgNCs用于檢測生物活性小分子GSH，該分子是在1929年由Hopkins發(fā)現(xiàn)并命名的[7]，在生物體中有兩種存在形式，GSH和GSSG，二者在正常人體內(nèi)的比例大約為100∶1。通常所常指的谷胱甘肽是GSH，具有清除自由基、解毒、保護肝臟、提高免疫力及抗癌等諸多作用，谷胱甘肽的檢測可以為病毒性肝炎、腦類疾病、免疫系統(tǒng)疾病等的診斷提供依據(jù)。

通過研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，筆者合成的DNA-AgNCs的熒光性質(zhì)穩(wěn)定，熒光強度高，在GSH的檢測中表現(xiàn)出了良好的特異性，能夠作為GSH體外檢測疾病診斷的檢測試劑，同時，通過結(jié)果筆者還發(fā)現(xiàn)，DNA-AgNCs的合成對DNA模板和緩沖體系都有一定要求，這對今后探討合成產(chǎn)物在熒光成像中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，值得進一步研究。

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（收稿日期：2019-05-05） （本文編輯：郎序瑩）