HMGB1基因多態(tài)性與豫北地區(qū)肺結(jié)核易感性的相關(guān)性

喬瑞娟， 程 睿， 李 威， 彭火英， 趙桂增， 張晨光

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.大慶油田總醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 大慶 163001)

肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis，PTB)是由結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性肺部疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1]。全世界約有三分之一的人口感染了 MTB，但只有大約10%的感染者出現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病，而其余的則沒(méi)有癥狀[2]，由此表明個(gè)體遺傳因素與肺結(jié)核的易感性密切相關(guān)。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)存在于人類(lèi)染色體上且分布廣泛，其可能影響啟動(dòng)子活性和基因表達(dá)，從而與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)許多基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性相關(guān)，如 CCL5、ASAP1、TLR10 基因內(nèi)的特定SNPs變異[3-5]。位于13號(hào)染色體的高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1 protein， HMGB1)是一種在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的普遍存在的核蛋白。HMGB1作為一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，在腫瘤、免疫性疾病和感染性疾病的發(fā)病過(guò)程中起重要作用[6-8]。在抗結(jié)核感染過(guò)程中，MTB感染可以誘導(dǎo)單核及巨噬細(xì)胞分泌HMGB1，其濃度的高低可能反映結(jié)核病的嚴(yán)重程度[9]。由此推測(cè)HMGB1基因多態(tài)性可能與肺結(jié)核易感性有很大關(guān)聯(lián)。迄今為止還未發(fā)現(xiàn)關(guān)于HMGB1 SNPs與肺結(jié)核易感性之間的關(guān)聯(lián)研究。本研究是首次對(duì)豫北地區(qū)肺結(jié)核患者和健康人群HMGB1基因的3個(gè)SNPs進(jìn)行病例對(duì)照研究，以探討HMGB1 SNPs與豫北地區(qū)肺結(jié)核患者易感性的相關(guān)性，為肺結(jié)核的診斷治療提供新的方向。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究選取2017年1—12月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院被確診為肺結(jié)核的320例患者作為結(jié)核組，診斷均符合我國(guó)肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 196-2017)。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)患心、肝、腎等疾病患者；(2)各類(lèi)腫瘤及自身免疫性疾病患者；(3)慢性呼吸系統(tǒng)疾病如慢性支氣管炎、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張的患者；(4)慢性感染如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等患者。對(duì)照組由該院同時(shí)期300名健康體檢者組成，均無(wú)慢性疾病及傳染病。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，事先獲得參與本次研究的每位患者和健康者的知情同意，自愿參與本項(xiàng)研究。

1.2 基因組DNA提取 結(jié)核組和對(duì)照組分別采集2～3 mL EDTA-K2抗凝全血，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)外周血基因組提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)從 EDTA-K2抗凝全血中分離出全血 DNA。提取的全血 DNA 保存于-20℃冰箱備用。

1.3 SNPs選擇及基因分型 選 擇 rs1412125(-1615A/G)、rs1045411(+1177G/A)、rs2249825(+3814C/G)三個(gè)位點(diǎn)，都是常見(jiàn)SNPs，這些SNPs的次要等位基因頻率均≥5%。rs1412125、rs1045411、rs2249825引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增體系共26 μL，包括2×PFUMasterMix 12．5 μL(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、去離子水10．5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 1 μL。HMGB1 rs1412125擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min的初始變性，然后是94℃ 30 s，55．9℃ 30 s，72℃ 2 min，共循環(huán)35次，最后在72℃延伸5 min；HMGB1 rs1045411擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min的初始變性，然后是94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共循環(huán)35次，最后在72℃延伸5 min；HMGB1 rs2249825擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min的初始變性，然后是94℃ 30 s，57．6℃30 s，72℃ 2 min，共循環(huán)35次，最后在72℃延伸5 min。所有的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定擴(kuò)增目的產(chǎn)物的有無(wú)。擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNASTAR V7.0軟件記錄相應(yīng)的SNPs位點(diǎn)。

表1 HMGB1 SNPs引物序列

2 結(jié)果

2.1 基本情況 320例結(jié)核組患者中男性123例(38．44%)，女性197例(61．56%)，平均年齡(37．91±11．01)歲。對(duì)照組300名健康體檢者中男性102例(34．00%)，女性198例(66．00%)，平均年齡(38．57±10．89)歲。所有的參與者均為漢族。兩組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0．05)。見(jiàn)表2。

2.2 兩組間的3個(gè) HMGB1 SNPs等位基因和基因型分布比較 兩組間3個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率均符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0．05)。rs1045411G/A位點(diǎn) A 等位基因與肺結(jié)核的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(OR=1．485，95%CI=1．110～1．986，P=0．007)，但兩組間rs1412125A/G 和rs2249825C/G 位點(diǎn)等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。見(jiàn)表3。在健康對(duì)照和肺結(jié)核患者中，rs1412125A/G、rs1045411G/A、rs2249825C/G位點(diǎn)的基因型分布最高頻率分別為純合AA、GG、CC，結(jié)核組和對(duì)照組的rs1045411G/A 基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，而rs1412125A/G、rs2249825C/G 基因型分布在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)，見(jiàn)表4。

表2結(jié)核組與對(duì)照組的基本特征[例(%)]

Table2Basic characteristics of tuberculosis group and control group(No. of cases[%])

基本特征結(jié)核組(n=320)對(duì)照組(n=300)χ2P性別 女197(61.56)198(66.00)1.3190.251 男123(38.44)102(34.00)吸煙史 有97(30.31)105(35.00)1.5490.213 無(wú)223(69.69)195(65.00)飲酒史 有77(24.06)84(28.00)1.2490.264 無(wú)243(75.94)216(72.00)

2.3 rs1045411G/A位點(diǎn)的遺傳模型與肺結(jié)核易感性之間的關(guān)聯(lián) rs1045411G/A 位點(diǎn)的共顯性模型中，與 GG 基因型相比，AG 基因型(OR=1．447，95%CI：1．025～2．041，P=0．035)和 AA 基因型(OR=2．812，95%CI：0．985～8．033，P=0．045)與肺結(jié)核的易感性相關(guān)；rs1045411G/A 位點(diǎn)的顯性模型[(AG+AA) vs GG]也與肺結(jié)核的易感性相關(guān)(OR=1．524，95%CI：1．090～2．131，P=0．014)；而在rs1045411G/A位點(diǎn)的隱性模型中[(AG+GG) vs AA]，以及在rs1045411G/A 位點(diǎn)的超顯性模型中[AG vs (GG+AA)]，病例組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0．05)，見(jiàn)表5。

表3 結(jié)核組和對(duì)照組的等位基因分布[例(%)]

注：兩組間三個(gè)位點(diǎn)等位基因分布均符合H-W平衡(P>0.05)

表4結(jié)核組和對(duì)照組的基因型分布[例(%)]

Table4Genotype distribution in tuberculosis group and control group(No. of cases[%])

SNPs基因型病例組(n=320)對(duì)照組(n=300)χ2Prs1412125 A/GAA191(59.69)190(63.33)0.9890.610AG110(34.37)92(30.67)GG19(5.94)18(6.00)rs1045411 G/AGG196(61.25)212(70.67)7.5870.023AG111(34.69)83(27.67)AA13(4.06)5(1.66)rs2249825 C/GCC222(69.37)227(75.67)3.0740.215CG91(28.44)68(22.67)GG7(2.19)5(1.66)

2.4 連鎖不平衡分析 rs1412125A/G與rs2249825C/G 之間 D′與r2分別為(0．24，0．30)；rs1412125A/G 與rs1045411G/A 之間 D′與r2分別為(0．53，0．22)；rs2249825C/G 與 rs1045411G/A之間 D′與r2分別為(0．37，0．10)。見(jiàn)圖1。

圖1 HMGB1 3個(gè)SNPs的連鎖不平衡分析

Figure1Analysis on linkage disequilibrium of three SNPs of HMGB1

表5 rs1045411G/A 位點(diǎn)不同遺傳模型與肺結(jié)核易感性的關(guān)聯(lián)[例(%)]

3 討論

肺結(jié)核是由 MTB引起的慢性肺部疾病，僅5%～10%的 MTB感染者會(huì)發(fā)展成具有臨床癥狀的疾病，多達(dá)90%的感染者為無(wú)癥狀感染[1-2]，因此，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注宿主的個(gè)體易感性。近年來(lái)，肺結(jié)核易感基因位點(diǎn)的多態(tài)性已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，研究[10]證明遺傳因素與結(jié)核的感染和易感性密切相關(guān)。Mishra等[3]發(fā)現(xiàn) CCL5的-403G>A SNPs 與 PTB 易感性存在顯著關(guān)聯(lián)。Curtis等[4]發(fā)現(xiàn) ASAP1基因的SNPs與俄羅斯人群中 TB 的易感性相關(guān)。Li等[5]發(fā)現(xiàn)IFNG 基因rs2069718 TT 基因型與肺結(jié)核感染期間中的保護(hù)作用相關(guān)。因此，候選基因的選擇和其多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)一直被認(rèn)為是 TB預(yù)防和治療的突破。

HMGB1是一種存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白。HMGB1在細(xì)胞內(nèi)外發(fā)揮多種作用，如免疫應(yīng)答，DNA 修復(fù)，染色質(zhì)穩(wěn)定化，細(xì)胞凋亡和基因轉(zhuǎn)錄。HMGB1作為晚期炎癥介質(zhì)在腫瘤和各種炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-8]。與此同時(shí)，HMGB1在慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺癌、哮喘等慢性肺部疾病中有較高水平表達(dá)[10-13]，表明 HMGB1可能作為一種晚期促炎細(xì)胞因子參與肺部相關(guān)疾病的發(fā)病過(guò)程。肺結(jié)核患者體內(nèi)的許多固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞是產(chǎn)生HMGB1的主要細(xì)胞[14]。HMGB1在肺結(jié)核組織和血清中表達(dá)升高，表明 HMGB1可能參與抗結(jié)核反應(yīng)，并且可以一定程度上反映組織的損傷程度[9]。但目前尚未發(fā)現(xiàn) HMGB1基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性有相關(guān)性的報(bào)道。因此，本研究是對(duì) HMGB1基因多態(tài)性與豫北地區(qū)肺結(jié)核易感性的相關(guān)性首次探討。

在本研究中，通過(guò)對(duì)HMGB1 rs1412125(-1615A/G)、rs1045411(+1177G/A)、rs2249825(+3814C/G)三個(gè)位點(diǎn)SNPs基因分型來(lái)檢測(cè)HMGB1基因多態(tài)性與 PTB 易感性的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，+1177G/A位點(diǎn)A等位基因可增加患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)(OR=1．485，95%CI：1．110～1．986，P=0．007)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，+1177G/A 基因型分布在結(jié)核組和對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．023)，AG 基 因 型 (95%CI：1．025～2．041，P=0．035)發(fā)生肺結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)是 GG 基因型的1．447倍，AA 基因型(95%CI：0．985～8．033，P=0．045)發(fā)生肺結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)是 GG 基因型的2．812倍。這些數(shù)據(jù)表明rs1045411(+1177G/A)位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性相關(guān)。基因3’側(cè)翼區(qū)域的多態(tài)性可以控制基因表達(dá)，rs1045411(+1177G/A)多態(tài)性位于3’側(cè)翼區(qū)域，因此可能影響HMGB1基因的表達(dá)[8]，rs2249825(+3814C/G)多態(tài)性雖位于內(nèi)含子1中，但可能會(huì)影響v-Myb的結(jié)合位點(diǎn)，這被證明是HMGB1表達(dá)的強(qiáng)有力的增強(qiáng)子[15]，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)rs2249825多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性相關(guān)，rs1412125(-1615A/G)位于 HMGB1上游-1615堿基對(duì)，它可能與人類(lèi)切割的同源域結(jié)合，后者在抑制轉(zhuǎn)錄中起作用并起到轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用[16]；然而，該 SNPs也未發(fā)現(xiàn)與肺結(jié)核的易感性相關(guān)。為了找到最理想遺傳模型，本研究建立了rs1045411(+1177G/A)基因多態(tài)性的共顯性、顯性、隱性和超顯性模型。在rs1045411(+1177G/A)位點(diǎn)的顯性模型[(AG+AA) vs GG]也發(fā)現(xiàn)可以顯著增加患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)(OR=1．524，95%CI：1．090～2．131，P=0．014)，而在rs1045411位點(diǎn)的隱性模型和超顯性模型中，結(jié)核組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。連鎖不平衡在人類(lèi)基因組中表達(dá)，可以用作遺傳標(biāo)記定位參與疾病檢測(cè)和治療的相鄰變體，然而本次研究的 HMGB1的3個(gè)位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)連鎖現(xiàn)象(r2<0．8)。

總之，本研究提示rs1045411(+1177G/A)位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性顯著相關(guān)，同時(shí)為肺結(jié)核分子水平發(fā)病機(jī)制的確定提供基礎(chǔ)，這項(xiàng)研究可能會(huì)對(duì)肺結(jié)核的發(fā)展和治療提供新的思路。然而這項(xiàng)工作的局限性是缺乏患者的生存數(shù)據(jù)。因此，HMGB1多態(tài)性是否與肺結(jié)核患者的生存有關(guān)需要進(jìn)一步檢查。此外，需要包含更多個(gè)體的更大型研究來(lái)檢查HMGB1多態(tài)性在肺結(jié)核進(jìn)展中的功能。