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    二代測序在檢測感染性心內膜炎患者心臟瓣膜組織病原體中的應用

    2019-04-17 12:08:38張思明王飛燕
    中國感染控制雜志 2019年4期
    關鍵詞:革蘭瓣膜病原體

    程 軍,胡 歡,張思明,耿 潔,李 峰,王飛燕,周 洲,陳 曦

    (北京協(xié)和醫(yī)學院 中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院實驗診斷中心,北京 100037)

    感染性心內膜炎(infective endocarditis,IE)是一種以心臟瓣膜受累為標志的感染性疾病,其發(fā)病率約為3~10 例/10 萬人[1]。未得到正確、及時的治療,超過1/3 的IE 患者會在診斷后的第一年內死亡[2]。IE 患者的預后高度依賴早期、精準的抗菌藥物治療,因此,對引起IE 病原菌的鑒定至關重要。目前,IE 的診斷和抗菌藥物治療主要依賴于血培養(yǎng)及基于培養(yǎng)菌株的藥敏試驗結果。然而,采集血培養(yǎng)前使用抗菌藥物,某些苛養(yǎng)菌或者常規(guī)方法難于培養(yǎng)的微生物引起的IE,血培養(yǎng)常呈現陰性的結果[3-4]。在這種情況下,可能會出現誤診或抗菌藥物使用不合理的情況,嚴重影響IE 患者的預后。近十幾年來,分子生物學技術發(fā)展迅速,基于細菌保守序列16S rRNA 聚合酶鏈反應(PCR)技術已經被用于心臟換瓣術后摘除的瓣膜組織中病原體的檢測,其靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法,對常規(guī)可培養(yǎng)或者苛養(yǎng)菌也有較強的檢測能力。然而,基于16S rRNA的PCR 技術存在天然的缺陷,如不能檢測真菌,對混合感染也是無能為力[5-6]。近幾年來,以二代測序(next-generation sequencing,NGS)為代表的宏基因組學已經被用于直接檢測臨床標本中的病原菌[7]。評估NGS技術直接檢測心臟瓣膜病原菌的研究在國內外較少見,本研究以改良DUKE 標準為“金標準”,直接提取心臟瓣膜組織中的DNA,旨在評價NGS技術直接檢測心臟瓣膜病原菌的能力,為IE 的診斷和術后抗菌治療提供幫助。

    1 材料與方法

    1.1 標本來源及前處理 標本來自中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院2017年4月—2018年2月經心臟瓣膜置換術或者心臟瓣膜成形術后摘除的瓣膜組織,其中28 例來自成人外科中心,2 例來自小兒外科中心。31例標本中,根據IE 診斷的“金標準”改良Duke標準,20例為確診IE(D.IE)患者,4例為可能IE(P.IE)患者,陰性對照為剩余的7例排除IE(re-jected IE)的心臟瓣膜病患者。實驗室收到摘除的瓣膜組織后,立即在生物安全柜里用無菌的眼科手術剪把組織剪碎并隨機分為兩份,一份用于常規(guī)增菌培養(yǎng),另一份(約35 mg)放置于-80℃冰箱冷凍保存,供NGS測序及Sanger測序驗證使用。

    1.2 主要儀器與試劑 哥倫比亞血平板、麥康凱平板、腦心浸液(賽默飛世爾生物化學公司),Heal Force HF90 型CO2孵箱(上海力申科學儀器公司),-80℃低溫冰箱(日本三洋公司),高壓蒸汽滅菌器(山東新華公司),BACTEK FX400 全自動血培養(yǎng)儀及配套血培養(yǎng)瓶(美國BD公司),Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀及配套鑒定藥敏卡,VITEK MSTM 質譜儀(法國生物梅里埃公司),QIAamp DNA Mini Kit(德國Qiagen 公司),Premix TaqTM、DL2000 marker(大連TaKaRa公司),瓊脂糖凝膠(西班牙Biowest公司),GTQ-Cy-cler 96 擴增儀(德國海恩公司),DYY-6C 型電泳儀(北京六一儀器廠),GIS-2010 凝膠圖像分析儀(上海天能公司),引物及擴增產物測序由中美泰和生物公司完成,二代測序及生物信息學分析由深圳華大基因研究所完成。

    1.3 瓣膜培養(yǎng) 瓣膜組織在培養(yǎng)前,先用無菌的眼科手術剪盡可能的剪碎,然后加入5 mL 腦心浸液增菌,放置35℃ CO2孵箱中培養(yǎng)7 d。每日評估標本的增菌情況,若有渾濁及時轉種于哥倫比亞血平板、巧克力平板及麥康凱平板(賽默飛世爾公司)。未出現渾濁的標本,在第7天也轉種于血平板、巧克力平板及麥康凱平板。培養(yǎng)出的微生物使用MAL-DI-TOF質譜儀(法國VITEK 公司)進行鑒定,使用VITEK 2 Compact全自動藥敏分析儀進行藥敏試驗(法國VITEK 公司)。

    1.4 血培養(yǎng) 血培養(yǎng)的采集參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)的血培養(yǎng)臨床實踐指南(Princi-ples and procedures for blood cultures; Approved Guideline:M47A)。對疑似IE 的發(fā)熱患者,在使用抗菌藥物之前或者下次使用抗菌藥物之前(對已使用抗菌藥物的患者)從不同穿刺位點平均采集3 套血培養(yǎng),采集的血液被立即注入需氧瓶和厭氧瓶(成人每瓶8~10 mL 血液,兒童每瓶1~3 mL血液)。血培養(yǎng)瓶在2 h內被放入全自動血培養(yǎng)儀(美國BD公司)培養(yǎng)7 d,對培養(yǎng)陽性的標本及時轉種到哥倫比亞血平板、巧克力平板及麥康凱平板。微生物的鑒定和藥敏同瓣膜組織培養(yǎng)。

    1.5 NGS及生信分析 冷凍的標本恢復常溫后,用無菌的眼科手術剪剪碎。稱取約25 mg 的瓣膜組織加入蛋白酶K,消化過夜后使用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA,整個操作嚴格遵照廠家的說明書進行。提取的DNA 經超聲波處理被破碎成200~300 bp的片段,隨后開始文庫構建和測序,具體如下:使用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫插入片段大小,Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.)質控DNA 文庫濃度,經環(huán)化形成單鏈環(huán)形結構。環(huán)化后的文庫經滾環(huán)復制生成DNA 納米球。制備好的DNA 納米球加載至測序芯片,使用BGISEQ-500進行測序。測序數據下機后去除低質量的和長度小于35 bp的數據,以獲得

    高質量的數據。通過BWA 比對,將高質量數據中與人參考基因組序列相同的數據去除,剩下的數據用SNAP 等軟件進一步分析,去除低復雜度reads后與NCBI的NT 數據庫比對,并將比對結果進行Taxonomy注釋、分類,以及統(tǒng)計作圖。

    1.6 Sanger測序驗證 血培養(yǎng)、瓣膜培養(yǎng)和/或NGS檢測結果為陽性的標本進行Sanger測序驗證。Sanger測序所用的DNA 同NGS。引物由中美泰和生物公司合成。全序列引物為27f(序列為:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(序列為:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’),擴增產物長度約1 500 bp。擴增體系為50 μL:25 μL Premix TaqTM,10 μmol/L 上、下游引物各2 μL,2 μL DNA模板,以滅菌雙蒸水補足體積。反應條件為:96 ℃ 150 s;96 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃90 s,共30個循環(huán);72 ℃ 7 min。擴增產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察,陽性擴增產物送中美泰和公司進行測序,測序結果在NCBI Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/B-last.cgi?PROGRAM5blastn &PAGE_TYPE5BlastSear-ch&LINK_LOC5blasth ome)在線比對,以相似度最高者為準。比對相似度至少97%方可認為同一菌種,不能歸到種水平的只歸到屬水平。

    1.7 統(tǒng)計學分析 應用MedCalc統(tǒng)計軟件進行分析,采用靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值表示。

    2 結果

    2.1 患者基本資料 24 例IE 患者中,根據改良Duke標準,20例為D.IE,4例為P.IE 患者,其中男性占75.0%,平均年齡46.5歲。87.5%的IE 患者在入院前使用過抗菌藥物,非IE 患者僅占14.3%。IE 患者的C 反應蛋白和紅細胞沉降率均高于非IE患者(均P<0.05)。見表1。IE 患者瓣膜贅生物分布為主動脈瓣12 例(50.0%),二尖瓣4 例(16.7%),主動脈瓣+二尖瓣3例(12.5%)、主動脈瓣+三尖瓣2例(8.3%),未見3例(12.5%)。對照組均未見瓣膜贅生物。

    2.2 革蘭染色結果 31例患者中有3例無革蘭染色結果。在18例確診IE 患者中,14例革蘭染色陽性,陽性率為77.8%,其中13例(92.9%)為革蘭陽性(G+)球菌,1例為革蘭陰性(G-)桿菌。見表2。

    *: IE患者包括D.IE和P.IE的患者

    2.3 培養(yǎng)結果 20例D.IE 患者中,6例患者血培養(yǎng)陽性,陽性率為30.0%,其中4 株為草綠色鏈球菌,銅綠假單胞菌和科氏葡萄球菌各1株;在D.IE患者中,3例瓣膜培養(yǎng)陽性,分別為銅綠假單胞菌、絲狀真菌和糞腸球菌,陽性率為10.0%(A5樣本從臨床癥狀、病理圖片及革蘭染色結果看,絲狀真菌高度懷疑為污染菌,未計入陽性率統(tǒng)計)。見表2。

    2.4 NGS結果 20例D.IE 患者中,19例NGS檢測陽性,陽性率為95.0%,其中鏈球菌16 株,五日熱八通體、貝氏柯克斯體、銅綠假單胞菌各1 株。4例P.IE 患者中,3例NGS陽性,其中鏈球菌2株,貝氏柯克斯體1 株。排除IE 的7 例病例中,NGS檢測陽性1例,為貝氏柯克斯體。所有NGS結果與Sanger測序驗證的屬一致率為100.0%,種一致率為79.2%。

    2.5 4種方法的診斷性能 革蘭染色、血培養(yǎng)、瓣膜培養(yǎng)、NGS 診斷IE 的靈敏度分別為77.8%、30.0%、10.0% 及95.0%,特異度分別為100.0%、100.0%、100.0% 及85.7%,陽性預測值分別為100.0%、100.0%、100.0% 及95.0%,陰性預測值分別為63.6%、30.0%、28.0%及85.7%。見表3。

    表2 31例患者臨床診斷及主要實驗室檢測結果

    *:革蘭染色結果為查詢病歷病理科革蘭染色結果;#:根據患者臨床癥狀、病理圖片及革蘭染色,此結果高度懷疑為污染結果

    表3 不同方法診斷IE的診斷效能(%)

    *:2例D.IE 無革蘭染色數據,未入組本統(tǒng)計;#:1例陰性對照標本無血培養(yǎng)數據,未入組本統(tǒng)計

    3 討論

    在臨床實踐中,IE 的早期診斷及針對性治療一直是個難題。通過查詢病歷及電話回訪,發(fā)現高達87.5%的患者收入本院前在下級醫(yī)院或者家中服用過抗菌藥物,可能是IE 早期癥狀與普通感染性疾病(如感冒)相似,造成臨床醫(yī)生或者患者誤判。采集血培養(yǎng)前使用抗菌藥物極大地影響了IE 患者血培養(yǎng)的陽性率,可能是本院IE 血培養(yǎng)陽性率低于國際平均水平的主要原因[8]。這種狀況更可突顯NGS技術在檢測IE 病原菌中的優(yōu)勢。從理論上講,只要樣本中還存在病原菌的核酸物質,NGS技術就可以從臨床樣本中直接檢測出包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲等所有類型的病原體[9]。當然,這也預示著NGS檢測出的病原體有可能是殘留的已死亡的病原體[10-11]。即使檢出的是已死亡的病原體,對于IE患者瓣膜置換術后針對性的預防治療也至關重要。IE 患者瓣膜置換術后若不接受系統(tǒng)的、規(guī)范的抗菌治療就會存在很大的復發(fā)風險。在研究中還發(fā)現相比血液、胸腔積液和尿液等無菌體液[12-13],心臟瓣膜組織中病原體的核酸更為富集,本研究中的很多樣本病原體的reads 數能達到上千甚至十萬個數量級。

    本研究中1 例樣本(A5)的瓣膜培養(yǎng)結果為絲狀真菌,而革蘭染色、NGS結果及Sanger測序均為G+球菌,臨床表現也不支持真菌感染,此結果應為假陽性,很可能是由實驗室培養(yǎng)或者轉種過程中污染導致的。樣本A16、A23 的培養(yǎng)結果均為凝固酶陰性葡萄球菌,NGS和Sanger測序是一致的,均為鏈球菌。凝固酶陰性葡萄球菌雖然也可引起IE,但是作為皮膚表面的定植菌,鏈球菌更容易被認為是IE 的病原菌[14]。1例D.IE(A9)的病例革蘭染色、血培養(yǎng)、瓣膜培養(yǎng)、NGS 及Sanger測序卻均為陰性,可能與患者處于炎癥恢復期和/或者樣本取材的部分不合理有關。1例D.IE 的病例(A15),瓣膜培養(yǎng)經VITEK 2 Compact鑒定藥敏儀和VITEK MS質譜儀雙重鑒定均為糞腸球菌,NGS 和Sanger驗證卻均為格登鏈球菌,可能與腸球菌、鏈球菌的基因序列存在較高同源性有關(早期的細菌學分類將腸球菌歸為D 群鏈球菌)[15]。1 例陰性對照樣本(A27),臨床診斷為風心病,血培養(yǎng)、瓣膜培養(yǎng)均為陰性,但是NGS 檢測出貝氏柯克斯體(907 條reads)。通過查詢病歷,與病理科醫(yī)生和臨床醫(yī)生深入探討,一致認為此患者可能為風心病引起的IE患者,臨床存在漏診的可能。如果此病例為真陽性的話,本研究計算的NGS 檢測病原菌的靈敏度和特異度將會更高。

    總而言之,相比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法,NGS 在診斷IE時具有很多優(yōu)勢[16],具體如下:(1)NGS 檢測IE 患者病原體的靈敏度遠高于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法,尤其是對難于培養(yǎng)的苛養(yǎng)菌。本研究中NGS 檢測的苛養(yǎng)菌占總數的34.8%(包括五日熱八通體1 例、貝氏柯克斯體3例、缺陷乏氧菌4 例)。隨著NGS 技術在檢測IE 病原體上的廣泛應用,更多未知的病原體可能會被檢出,甚至會顛覆人們對IE 病原譜的傳統(tǒng)認識。(2)隨著NGS技術的成熟,NGS檢測病原體的周期將會縮短至2 d,遠低于傳統(tǒng)培養(yǎng)所需的5~7 d,甚至是更長時間。(3)NGS技術能夠檢測包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲在內的所有病原體,克服了基于16S rRNA 的傳統(tǒng)PCR 方法只能檢測細菌,對真菌或者混合感染無能為力的缺點。國外文獻[17]報道,約2%的IE 是由真菌引起的。(4)隨著大數據的應用和生物信息學的發(fā)展,NGS技術在檢測病原體的同時還能檢測耐藥基因,對于培養(yǎng)結果陰性的IE 患者尤為重要,因為NGS不僅可以用于IE 的診斷,還可對IE 患者的抗菌治療提供幫助。當然,NGS作為一項新技術也存在很多局限性,如NGS的生信分析缺乏統(tǒng)一的標準,不能確定檢測的細菌是否已經死亡,以及測序結果與疾病之間的關系尚不明確等問題。相信隨著國家相關標準的形成,NGS完整基因數據庫的建立及NGS技術的進一步發(fā)展,這些不足或許會得到改善或者被克服,NGS在IE 的診斷和抗菌治療上將發(fā)揮更大的作用。

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