絞股藍皂苷XLIX的研究概況

胡曉安 胡萌萌 吳 晗 馬鵬飛 張 莉

1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西西安 710061；2.西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，陜西西安 710061;3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西西安 710065

絞股藍Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino，又名七葉膽、遍地生根、公羅鍋底、小苦藥、五葉參、日本名甘茶蔓[1]等，是葫蘆科絞股藍屬多年生攀援草質(zhì)藤本植物[2]。味甘、苦，性寒，歸肺、脾、腎經(jīng)。絞股藍中含有皂苷、多糖、黃酮、甾醇類、氨基酸及微量元素等多種化學(xué)成分[3-5]。目前普遍認為皂苷、黃酮等是其主要活性成分，已知含有包括絞股藍皂苷A、絞股藍皂苷XLIX 等140余種絞股藍皂苷以及商陸素、蘆丁、槲皮素等10余種黃酮類成分[6]，是目前所知非五加科人參屬植物中唯一含有人參皂苷類成分的植物[3]。該屬植物基源復(fù)雜、品種繁多，全世界已知絞股藍屬植物有17種、2變種，我國有14種、2變種[7]，其中9種、2變種為我國特有種。絞股藍多分布于亞熱帶和北亞熱帶地區(qū)，我國主要分布于秦嶺和長江以南地區(qū)[8]，其中陜西安康的平利縣、寧陜縣盛產(chǎn)絞股藍，因此平利被列為中國絞股藍原產(chǎn)地。

絞股藍總苷（gypenoside）是以絞股藍為原料經(jīng)提取分離制成的總苷原料藥，其藥品制劑有絞股藍總苷片[9]、絞股藍總苷膠囊[10]等，臨床功能主治養(yǎng)心健脾，益氣和血，除痰化瘀，降血脂。用于高血脂癥，見有心悸氣短，胸悶肢麻，眩暈頭痛，健忘耳鳴，自汗乏力或脘腹脹滿等心脾氣虛，痰阻血瘀者[11-12]。

在絞股藍的皂苷類、黃酮類、多糖類、維生素、氨基酸等多種生理活性物質(zhì)中，其中皂苷類是其主要活性成分[13]，日本學(xué)者家竹本常松于1983年在絞股藍中發(fā)現(xiàn)絞股藍皂苷XLIX（CAS號：94987-08-3），并對其進行結(jié)構(gòu)鑒定和確證[14]。藥理學(xué)研究表明，絞股藍皂苷XLIX具有抑制腫瘤生長、保護心腦血管系統(tǒng)、降低血糖、調(diào)節(jié)血脂平衡、減少氧化應(yīng)激等作用[15-19，31]。其含量在絞股藍總苷中高達6%～20%，為其中含量最高的活性特征成分之一[19]，且專屬性強，目前尚未發(fā)現(xiàn)在其他科屬植物中該組分的報道。

1 絞股藍皂苷XLIX的提取與純化[6，20]

絞股藍總皂苷原料提取純化用正相硅膠短柱，首先用乙醇洗脫，再用氯仿、乙酸乙酯、甲醇組成的流動相采用極性增加的梯度進行洗脫，分別收集得到10個餾分（A-J），評價其對VCAM-1的抑制活性，經(jīng)重新分級后產(chǎn)生6個級分（J-1～6）。 將包含絞股藍皂苷XLIX級分的J-6使用制備液相進一步純化，色譜條件：制備柱C18， 用33%乙腈水洗脫液等度洗脫，檢測波長206nm。經(jīng)純化的絞股藍皂苷XLIX含量可達到98%以上。

2 絞股藍皂苷XLIX的結(jié)構(gòu)鑒定和確證

絞股藍皂苷XLIX屬達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷[3]。其分子結(jié)構(gòu)特點是分子中C8位有β構(gòu)型的角甲基。C13位有β氫，C10位有β醛基，C14位有α甲基，C17位有β側(cè)鏈，C20位為S構(gòu)型，苷元的C3位連有鼠李糖、木糖和阿拉伯糖構(gòu)成的糖鏈，C20位連有葡萄糖。根據(jù)13C-NMR，DEPT，MS 及元素分析確定分子式為C52H86O21，分子量為1047.23，Liebermann反應(yīng)陽性。IR：在3418cm-1，1044cm-1處有強的羥基吸收；在1701cm-1處有一羰基吸收峰；1379cm-1，1260cm-1處有四環(huán)三萜的特征吸收峰。其乙酰化物的IR譜無羥基吸收。1H-NMR譜在δ 5.02ppm（1H，d，J=7.89 Hz）處多一個質(zhì)子信號，歸屬于葡萄糖的端基質(zhì)子。13C-NMR譜中C21δ 66.87ppm向低場位移至76.36ppm，說明分子中C21羥基與糖結(jié)合成苷。δ46.13，76.31及36.70ppm各信號分別歸屬于C17，C20及C22。受C21羥基苷化的影響，各碳原子分別位移-0.06，-0.20和+0.05ppm，多出一組葡萄糖信號，分別為δ106.25，75.54，78.65，71.82，78.71和62.93ppm。經(jīng)綜合解析，確定其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 絞股藍皂苷XLIX結(jié)構(gòu)式

3 絞股藍皂苷的藥理作用

絞股藍中含有多種皂苷、黃酮、氨基酸以及多糖等活性成分，自1976年日本學(xué)者從絞股藍中分離出達瑪烷型皂苷以來，各國學(xué)者已經(jīng)從絞股藍中提取得到了上百種絞股藍皂苷[21-23]，并一直研究其藥理作用。目前已經(jīng)證實絞股藍皂苷具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗阿爾茨海默病、抗焦慮、抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠、降血糖以及免疫調(diào)節(jié)等作用[15-18]，其中養(yǎng)心健脾、益氣活血、除痰化瘀、降血脂作為明確療效寫入了絞股藍總皂苷說明書中。

3.1 調(diào)節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化

絞股藍皂苷可有效預(yù)防和治療高脂血癥以及動脈粥樣硬化，這種調(diào)節(jié)血脂的作用與抑制脂肪細胞產(chǎn)生游離脂肪酸及促進合成中性脂肪有關(guān)[21，23]。絞股藍皂苷能夠不同程度地降低高脂動物血清中的總膽固醇（TC），甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）濃度，顯著增加血液中的高密度脂蛋白（HDL），并且可顯著降低內(nèi)皮素（ET），從而降低動脈粥樣硬化的發(fā)病率，在預(yù)防和治療心腦血管疾病新藥研發(fā)方面具有開發(fā)價值[8，25]。

3.2 抗腫瘤作用

絞股藍皂苷具有顯著的體內(nèi)外抗腫瘤作用[8]，研究表明其可以明顯抑制體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞、腫瘤細胞、腎上腺皮質(zhì)癌細胞以及人急性白血病細胞增殖，同時對正常細胞增殖無不良影響[8]。在小鼠結(jié)腸癌模型中用絞股藍總皂苷連續(xù)給藥出現(xiàn)顯著療效，與5-氟尿嘧啶協(xié)同化療時療效顯著；絞股藍總皂苷在體外能有效抑制人的腎上腺皮質(zhì)癌細胞（ACC SW-13）的增殖，其機制可能與上調(diào)caspase-8 m RNA的表達相關(guān)[26]。絞股藍總皂苷可改變?nèi)思毙园籽〖毎℉L-60）的形態(tài)，降低細胞活性， 誘導(dǎo)G0/G1期細胞停滯，使DNA破碎，并促使HL-60細胞凋亡[27]。

3.3 抗阿爾茲海默病

阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，起病隱襲，病程呈慢性進行性，是老年期癡呆最常見的一種類型。姚柏春等[24]探討了絞股藍皂苷（GPM）改善癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用及機制，絞股藍皂苷能對抗自由基的氧化損傷、修復(fù)線粒體的超微結(jié)構(gòu)進而改善SDAT鼠的認知能力，其機制可能與其減輕腦組織抗氧化損傷、減少Aβ表達有關(guān)[24]。本研究有希望用于人類老年癡呆癥疾病的治療，為絞股藍資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

3.4 降血糖作用

糖尿病已成為世界第3大慢性疾病，研究表明絞股藍降血糖作用的主要成分是皂苷與多糖。近年發(fā)現(xiàn)其作用機制可能與激活Nrf2信號通路有關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍內(nèi)生真菌JY25多糖對α-葡萄糖苷酶有競爭性抑制作用，與糖尿病臨床防治藥物阿卡波糖的抑制類型相同，具有開發(fā)成新型降血糖藥物和保健品的潛能[23]。

3.5 抗衰老作用

研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍提取液的抗衰老作用主要通過增強血液超氧化物歧化酶（SOD）活性，同時降低自由基活性而實現(xiàn)的[28]。絞股藍皂苷能阻止脂質(zhì)過氧化，減少Ca2+內(nèi)流，明顯抑制谷氨酸鹽下調(diào)Bcl-2蛋白、上調(diào)Bax蛋白表達，進而降低谷氨酸引起的細胞凋亡[29]；絞股藍皂苷還可以通過減少細胞內(nèi)過氧化物的堆積，降低谷胱甘肽（GSH）的消耗，增加細胞內(nèi)GSH 含量[8]。

3.6 鎮(zhèn)靜催眠作用

江硯等[30]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍總皂苷具有明顯的鎮(zhèn)靜、催眠作用，能顯著延長閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間[8]。GABA對哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有普遍的抑制作用，研究顯示其可通過介導(dǎo)褪黑素促進睡眠。絞股藍總皂苷不僅可顯著降低大鼠下丘腦內(nèi)DA、NE含量，還可使IL-lβ含量增高[23，30]。

3.7 抗焦慮作用

絞股藍總皂苷連續(xù)給藥可恢復(fù)由慢性足底電擊應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠大腦內(nèi)DA和5-羥色胺水平降低情況，并且可調(diào)節(jié)c-Fos蛋白的表達水平和腎上腺皮質(zhì)的水平，改善小鼠的焦慮癥狀[23]。

3.8 免疫調(diào)節(jié)作用

絞股藍中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要成分是皂苷與多糖[23]。研究表明，絞股藍總皂苷連續(xù)用藥可增強正常小鼠淋巴細胞的增殖，可顯著增強巨噬細胞的吞噬功能，提高免疫器官指數(shù)，提高小鼠血清溶血素含量，對細胞免疫和體液免疫都有增強的作用。能提高正常機體非特異性免疫能力[22-23]。

絞股藍其良好的臨床療效已經(jīng)在長期、大量實踐中得到證明，近年來，以絞股藍為主研發(fā)的保健食品層出不窮，而以絞股藍總皂苷涉及的藥品劑型也是豐富多樣，包括片劑、膠囊劑、滴丸劑、軟膠囊劑、顆粒劑等，幾乎涵蓋了所有口服劑型。另外絞股藍總皂苷由于其確切的降脂作用，寫入了相關(guān)制劑的說明書中，與化學(xué)降脂藥品相比較，其無明顯副作用，且在降脂的同時，能明顯控制血糖升高與減少糖尿病作用。

4 絞股藍皂苷XLIX的藥效機制研究

從20世紀80年代起，有關(guān)絞股藍及提取物總苷的藥理研究報導(dǎo)甚多，充分證明了其具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗阿爾茨海默病、抗焦慮、抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠、降血糖以及免疫調(diào)節(jié)等作用[15-18]，并在長期的臨床應(yīng)用中證明了其確切療效，未見不良反應(yīng)的報導(dǎo)，但絕大部分是對絞股藍總苷原料藥及制劑的藥理研究，而對有效單體成分的藥理活性和作用機制缺乏深層次的研究。絞股藍皂苷XLIX是絞股藍中的主要活性成分之一，Huang等[31]在2007年對絞股藍皂苷XLIX分子的抗炎、抗癌和抗動脈粥樣硬化作用機制進行了深入研究，結(jié)果表明絞股藍皂苷XLIX是一種天然的選擇性過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-α激活劑，其活性類似于Wy-14643， 通過PPAR-α途徑產(chǎn)生抗炎，抗癌和抗動脈粥樣硬化作用的機制有以下六點。

4.1 抑制核因子-κB的激活[31-32]

核因子-κB（NF-κB）體系主要涉及機體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞，在炎癥的產(chǎn)生中起重要作用。在Huang等[31]的研究報告中進一步證明了絞股藍皂苷XLIX作為過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）-α激活劑，除了能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝外，還能減少NF-κB活化，終止炎癥通路的激活。通過研究絞股藍皂苷XLIX（Gyp-XLIX）對細胞系中內(nèi)毒素（LPS-）和腫瘤壞死因子（TNF-α）誘導(dǎo)的I-κBα抑制和NF-κB活化的影響。 以PDTC為吡咯烷二硫代氨基甲酸作為陽性對照，結(jié)果顯示陽性對照PTDC完全抑制了由LPS誘發(fā)的RAW 264.7巨噬細胞中NF-κB啟動子的活化，絞股藍皂苷（GP）提取物和Gyp-XLIX也有效地抑制了NF-κB啟動子活性[32]。

4.2 抑制細胞因子對于人內(nèi)皮細胞表達血管粘附因子-1 （VCAM-1）的誘導(dǎo)作用[32]

血管細胞粘附因子-1（VCAM-1）涉及多種疾病，其中包括慢性炎癥和動脈粥樣硬化?？寡?，抗癌和抗動脈粥樣硬化藥物的一個關(guān)鍵目標(biāo)就是要抑制這種粘附因子的表達式。在使用VCAM-1特異性單克隆小鼠抗體進行酶免疫測定的結(jié)果顯示，絞股藍皂苷XLIX抑制了人工培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中細胞表面VCAM-1的誘發(fā)。抑制VCAM-1活性是治療一些炎癥和心血管疾?。ò▌用}粥樣硬化）的重要機制之一。

在研究中進一步證實了絞股藍皂苷XLIX通過PPAR-α途徑抑制VCAM-1活性。與對Wy-14643的作用相似，特異性PPAR-α抑制劑MK-886作用完全相反，絞股藍皂苷XLIX對TNF-α刺激的VCAM-1熒光素酶活性的增加起到抑制作用。

4.3 抑制TNF-α誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞表達VCAM-1mRNA的作用[33]

研究者在對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中TNF-α（炎癥介質(zhì)）誘發(fā)的VCAM-1核糖核酸和蛋白表達式影響的實驗中，將細胞用Wy-14643，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯，絞股藍皂苷XLIX或載體（0.1%二甲基亞砜）預(yù)處理30min。再用TNF-α刺激5h，處理后，收集核糖核酸和蛋白質(zhì)，并分別通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡法進行分析。 結(jié)果顯示，TNF-α誘發(fā)的VCAM-1核糖核酸和蛋白質(zhì)超約3倍表達，可以由吡咯烷二硫代氨基甲酸酯完全抑制，絞股藍皂苷XLIX濃度依賴性地降低TNF-α誘發(fā)的VCAM-1核糖核酸和蛋白質(zhì)表達式的程度，可達到相同濃度下與正控制Wy-14643相當(dāng)?shù)某潭取?/p>

4.4 抑制LPS誘導(dǎo)THP-1單核細胞表達組織因子的作用[34]

研究報告顯示，用不同濃度的絞股藍皂苷XLIX預(yù)處理單核細胞THP-1一定時間后，分別用RT-PCR檢測由細菌脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的THP-1單核細胞TF mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。結(jié)果顯示：絞股藍皂苷XLIX減少了LPS誘導(dǎo)的人單核細胞TF mRNA和蛋白質(zhì)的表達。表明絞股藍皂苷XLIX抑制LPS誘導(dǎo)THP-1單核細胞表達組織因子的表達，此機制證明絞股藍皂苷XLIX是一種PPAR-α激動劑，起到了抗動脈粥樣硬化作用。

4.5 調(diào)節(jié)游離脂肪酸代謝的作用[34]

研究表明，游離脂肪酸可通過抑制葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運、影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、引起胰島細胞凋亡等多條途徑而引起胰島素抵抗。由于PPAR-α在調(diào)節(jié)脂肪代謝中起重要作用，PPAR-α激動劑可以降低血漿中游離脂肪酸的水平，達到改善胰島素抵抗、降低糖尿病發(fā)病率的目的[35-37]。絞股藍皂苷XLIX作為一種天然的PPAR -α激動劑，抑制了脂多糖誘導(dǎo)的THP-1在人單核細胞中的表達及活性。

4.6 改善糖尿病腎小球功能[38]

糖尿病腎病（DN）的發(fā)病率在逐年上升，其發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚未明確[36]。趙璐等[38]對絞股藍皂苷XLIX改善糖尿病大鼠腎小球功能的作用機制進行了研究，經(jīng)絞股藍皂苷XLIX治療的大鼠的尿蛋白含量、GFR、腎小球細胞凋亡比例明顯降低，而高密度脂蛋白（HDL）含量上升。模型組大鼠腎小球組織中Bcl-2蛋白表達下調(diào)而Bax蛋白表達上調(diào)、VCAM-1表達上升，絞股藍皂苷XLIX治療則可逆轉(zhuǎn)這些變化。絞股藍皂苷XLIX抑制模型大鼠腎小球細胞凋亡的試驗結(jié)果表明，降低了腎小球陽性細胞比例。絞股藍皂苷XLIX對腎小球組織蛋白表達的影響試驗結(jié)果表明，與正常組比較，模型組腎小球組織中Bcl-2蛋白表達降低，而Bax、VCAM-1蛋白表達升高。與模型組比較，中、高劑量絞股藍皂苷 XLIX 促進腎小球組織中Bcl-2蛋白表達，而抑制Bax、VCAM-1 蛋白的表達。以上研究可得出：絞股藍皂苷XLIX可降低糖尿病大鼠血糖、血脂水平，改善腎小球功能并通過PPAR-α調(diào)控VCAM-1的表達。

以上的研究結(jié)果表明，絞股藍皂苷XLIX治療動脈粥樣硬化、炎癥、心血管疾病以及糖尿病、腎病的作用機制是通過PPAR-α依賴途徑，抑制細胞因子誘導(dǎo)的VCAM-1過度表達式和人類內(nèi)皮細胞的活性[38]。為今后開發(fā)利用絞股藍皂苷XLIX治療多種疾病提供了科學(xué)依據(jù)。

5 展望

我國絞股藍植物資源豐富，絞股藍總苷制劑及保健食品在治療動脈粥樣硬化、炎癥、心血管疾病及糖尿病中取得了可靠的效果。如能進一步深入研究，繼續(xù)開展單一組分生物活性研究，將會使絞股藍的治療進入更加廣闊的天地，對于提高人民群眾的健康和促進國民經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。