安溪肉桂清咽保健功效評價研究

譚蓉 ， 張穎聰 ， 王靜 ， 張志騰 ， 楊秀芳 *

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省茶資源跨界應用技術(shù)重點實驗室，浙江杭州 310016；3.安溪縣穎昌茶廠，福建安溪 362400）

安溪肉桂產(chǎn)自安溪縣大坪鄉(xiāng)坪洲村。民間對肉桂茶清咽利喉的效果反饋良好，為了驗證這一特殊功效，文章擬通過體內(nèi)外試驗進行功效評價研究。以細菌感染引起的急慢性咽炎為評價指標，進行安溪肉桂的體外抑菌試驗研究，同時以《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003）的要求進行大鼠棉球植入試驗和大鼠足趾腫脹試驗，進一步對安溪肉桂清咽保健功效進行評價。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 體外抑菌試驗

試驗菌種：普通變形桿菌 CMCC（B）49027，肺炎鏈球菌ATCC49619，乙型溶血性鏈球菌ATCC21059，上海魯微科技有限公司。

試驗樣品：穎昌牌安溪肉桂干茶樣（茶多酚總量14.8%，兒茶素總量7.8%），安溪縣穎昌茶廠提供。

試驗試劑：甲醇、無水乙醇、氯化鈉、濃硫酸、氯化鋇，均為分析純；營養(yǎng)瓊脂，血瓊脂平板。

1.1.2 體內(nèi)功效評價

試驗動物：SD大鼠，清潔級，80只，體重160～180 g。購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心（動物質(zhì)量合格證號：0008677，許可證號：SCXK（浙）2008-0033）。于室溫 23±2 ℃，相對濕度 50%～70%飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

試驗樣品：穎昌牌安溪肉桂提取濃縮液，1 g/mL，分別用蒸餾水稀釋5倍、10倍和20倍，配制成濃度為0.2 g/mL、0.1 g/mL和0.05 g/mL的藥液備用。

陽性對照：清熱散結(jié)膠囊（江西普正制藥有限公司，批號 150508）；規(guī)格：0.35 g×12 ?！? 板，根據(jù)人用劑量和動物劑量換算，將膠囊內(nèi)含物用蒸餾水配制成濃度為63 mg/mL溶液備用。

致炎劑：用生理鹽水稀釋雞蛋清配成濃度為10%的蛋清溶液。

試驗試劑：TNF-α ELISA試劑盒，批號20151102B，上海源葉生物科技有限公司；IL-6 ELISA試劑盒，批號20151102B，上海源葉生物科技有限公司；IL-1β ELISA試劑盒， 批號20151102B，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AL-204型電子天平；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱；SYQDSX-280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱；YLS-7A型足趾容量測量儀，山東省醫(yī)學科學院設備站；Powerwave 340酶標儀，美國Bio-TEK公司；DGG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；CP114電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；Hirayama HVP-50高壓滅菌鍋，日本Hirayama；Heraeus Biofuge Stra冷凍離心機，德國Heraeus；DS-671電子計重秤，上海寺岡電子有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紙片抑菌法

參考WS/T 125—1999《紙片法抗菌藥物敏感試驗標準》進行試驗，其中部分步驟稍微修改，具體如下：

使用劃線法活化菌株，選擇平板上形態(tài)相同的菌落至少4～5個，用接種環(huán)挑起，移至5 mL的生理鹽水中，將菌液濃度調(diào)節(jié)至0.5麥氏單位比濁管。使用無菌棉簽，蘸取菌液，并在上端管壁旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多菌液，用棉簽涂布平板表面，保證涂布均勻。空白藥敏紙片（直徑6 mm）在提取液中浸泡1 h后，37℃下烘干，用于下一步的抑菌試驗。接種平板后，貼上已經(jīng)制備好的藥敏紙片，用鑷子壓一下紙片使其與培養(yǎng)基表面貼牢，每塊培養(yǎng)基貼6片。隨后將平板倒置放在35.5℃的生化培養(yǎng)箱中。經(jīng)16～18 h培養(yǎng)后觀察結(jié)果，測量抑菌圈大小，平行3次。

1.3.2 動物試驗方法

（1）分組與給藥

選取健康雄性SD大鼠40只，按體重隨機分為5組，每組8只，即陰性對照組、陽性對照組（清熱散結(jié)膠囊0.63 g/kg）、安溪肉桂提取物（0.5 g/kg）組、安溪肉桂提取物（1 g/kg）組、安溪肉桂提取物（2 g/kg）組。所有大鼠均給予基礎飼料，自由采食飲水。除陰性對照組灌服純凈水外，其余各給藥組分別灌服相應藥物，每日1次，按1 mL/100 g體重的標準，足趾腫脹模型連續(xù)給藥29 d，棉球肉芽腫模型連續(xù)給藥40 d。

（2）指標測定

足趾腫脹度測定：實驗結(jié)束灌服1 h后，將大鼠固定，于足外踝處畫1道橫線作標記。用容積測量法測足趾容積，將大鼠后肢拉直放入測量儀玻璃筒內(nèi)，觀察筒內(nèi)液體水平線與鼠足橫線標記處重疊時，測量儀數(shù)字顯示屏將顯示足趾容積數(shù)值（mL）。給藥前先測一次足趾容積；給藥后0.5 h，自足趾中部皮下注入致炎劑（10%蛋清）0.1 mL/只；分別于致炎 1 h、2 h、4 h、6 h后測量大鼠足趾腫脹程度。足趾腫脹度（mL）=給藥后足趾體積-給藥前足趾體積。

棉球肉芽腫重量測定：將脫脂棉制成約20 mg左右緊致的小棉球，經(jīng)高壓滅菌后，置恒溫干燥箱60°C干燥3 h，取出在無菌條件下稱重，干燥保存，備用。肉芽腫的形成和測定實驗結(jié)束前8 d，用脫毛器脫去大鼠兩側(cè)腹股溝處的毛，水合氯醛麻醉大鼠，碘伏消毒，在無菌條件下切開大鼠兩側(cè)腹股溝皮膚，植入備用的棉球，縫合切口，繼續(xù)給予樣品。末次給藥后禁食12 h，水合氯醛麻醉大鼠，在原縫合處剪開皮膚，剝離并取出棉球肉芽組織，恒溫干燥箱60°C干燥3 h后稱重，計算肉芽腫凈量。

肉芽腫凈量 （mg）=干燥后棉球肉芽腫重量-原棉球重量。

（3）炎癥因子測定

末次給藥后禁食12 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心制備血清，酶聯(lián)免疫法測定血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007對數(shù)據(jù)進行描述性分析，使用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。計量資料數(shù)據(jù)以±SD表示，組間比較采用 t-test，p＜0.05表示差異有顯著性。

表1 不同提取溶劑對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 1 Influence of different extraction solvents on disc diffusion zone diameters （Unit：mm，±SD ）

表1 不同提取溶劑對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 1 Influence of different extraction solvents on disc diffusion zone diameters （Unit：mm，±SD ）

注：不同字母表示存在顯著性差異，p＜0.05；-表示不抑菌，下同。Note： different letters indicated significant differences， p＜0.05.“-” indicated no bacteriostasis， the same as followed.

提取溶劑E x t r a c t i o n s o l v e n t乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s水--7.7 5±0.3 5 c普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 7 0%乙醇 - 9.6 7±0.2 9 b 9.8 0±0.2 7 b 7 0%甲醇 - 1 0.4 0±0.5 5 a 1 0.8 3±0.7 6 a

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗

2.1.1 提取溶劑對抑菌圈大小的影響

分別選擇水、70%甲醇及70%乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶4（w/v）（此處由于水作為溶劑時，提取料液比最高只能達到1∶4，再提高時基本沒有提取液），提取時間為20 min，提取溫度為70℃。三種提取溶劑所獲得的提取液抑菌效果如表1所示。由上表可知，70%甲醇提取液的抑菌效果較佳。隨后，又進行了不同濃度的甲醇提取液對抑菌效果的研究，料液比為 3∶10（w/v），其余提取條件一致，結(jié)果如表2所示。從結(jié)果可以看出，隨著甲醇濃度的增加，對三種菌的抑菌圈大小均呈先增大后減小的趨勢，且在70%的甲醇條件下，抑菌效果最佳。因此，后續(xù)試驗選擇70%甲醇作為提取溶劑。

表2 不同濃度的甲醇對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 2 Influenceofdifferentconcentrationsofmethanolondiscdiffusionzonediameters （Unit： mm，±SD）

表2 不同濃度的甲醇對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 2 Influenceofdifferentconcentrationsofmethanolondiscdiffusionzonediameters （Unit： mm，±SD）

甲醇濃度M e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 6 0%甲醇 7.0 0±0.0 0 a 9.2 5±0.3 5 b 9.7 5±0.3 5 b 7 0%甲醇 7.2 5±0.3 5 a 1 0.5 0±0.7 1 a 1 1.7 5±0.3 5 a 8 0%甲醇9 0%甲醇普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e- -9.0 0±0.0 0 b-9.2 5±0.3 5 b 8.0 0±0.0 0 c

2.1.2 提取溫度對抑菌圈大小的影響

分別選擇60℃、70℃、80℃和90℃為提取溫度，料液比為 3∶10（w/v），提取時間為 20 min，考察相應提取液抑菌圈的大小，結(jié)果如表3所示.從結(jié)果可以看出，70℃和90℃提取時提取液抑菌圈最大，且與另外兩個提取溫度下提取液的抑菌圈大小均存在顯著性的差異（p＜0.05）。綜合考慮，后續(xù)使用70℃作為提取溫度。

表3 不同提取溫度對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 3 Influence of different extraction temperatures on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

表3 不同提取溫度對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 3 Influence of different extraction temperatures on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

溫度T e m p e r a t u r e乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 6 0 ℃ - 7.7 5±0.3 5 b 8.5 0±0.0 0 b 7 0 ℃ 7.2 5±0.3 5 b 1 0.5 0±0.7 1 a 1 1.1 7±0.2 9 a 8 0℃9 0℃普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e-9.2 5±0.3 5 a 7.7 5±0.3 5 b 9.2 5±0.3 5 a 8.7 5±0.3 5 b 1 1.5 0±0.7 1 a

2.1.3 提取時間對抑菌圈大小的影響

分別選擇 5 min、10 min、20 min 和 30 min 為提取時間，料液比為 3∶10（w/v），考察相應提取液抑菌圈的大小，結(jié)果如表4所示，從表中可以看出，提取時間在20 min時，對三種菌的抑菌圈效果較好，且與30 min的結(jié)果沒有顯著性的差異。因此，后續(xù)試驗選擇20 min作為提取時間。

表4 不同提取時間對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 4 Influence of different extraction time on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

表4 不同提取時間對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 4 Influence of different extraction time on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 5 m i n - 8.7 5±0.3 5 b 9.7 5±0.3 5 b 1 0 m i n - 9.5 0±0.5 0 b 9.8 3±0.2 9 b 2 0 m i n 3 0 m i n時間T i m e普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 7.2 5±0.3 5 a 7.3 3±0.2 9 a 1 0.5 0±0.7 1 a b 1 0.7 5±0.3 5 a 1 1.1 7±0.2 9 a 1 1.2 5±0.3 5 a

2.1.4 不同料液比對抑菌圈大小的影響

根據(jù)上述獲得的較優(yōu)提取條件，考察不同料液比對三種菌的抑菌效果，結(jié)果如表5所示，從結(jié)果中可以看出，抑菌圈的大小都隨著料液比的增加而增大。當料液比達到3.5∶10后，三種菌的抑菌圈均不再顯著增加（p＜0.05）。但是三種菌的最佳料液比有一定的差異，以最先出現(xiàn)顯著性差異的結(jié)果為最佳比例，普通變形桿菌為3.5∶10，肺炎鏈球菌為 2.5∶10，乙型溶血性鏈球菌為 3∶10。

表5 不同料液比對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 5 Influence of different solid-liquid ratio on disc diffusion zone diameters(Unit:mm,±SD)

表5 不同料液比對抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 5 Influence of different solid-liquid ratio on disc diffusion zone diameters(Unit:mm,±SD)

料液比S o l i d-L i q u i d r a t i o乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 1∶1 0 - - -1.5∶1 0 2∶1 0普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e---9.2 5±0.3 5 b 8.2 5±0.3 5 c 1 0.2 5±0.3 5 b 2.5∶1 0 3∶1 0 3.5∶1 0 4∶1 0-7.2 5±0.3 5 b 7.6 7±0.2 9 a 8.6 7±0.2 9 a 1 0.4 0±0.5 5 a 1 0.5 0±0.7 0 a 1 0.1 0±0.2 2 a 1 0.5 0±0.5 0 a 1 0.8 3±0.7 a b 1 1.1 7±0.2 9 a 1 1.4 0±0.2 2 a 1 1.5 0±0.5 0 a

綜上，安溪肉桂對三種菌均有一定的抑制效果，其中對乙型溶血型鏈球菌的抑制效果最佳，其次是肺炎鏈球菌，對普通變形桿菌的抑制效果較弱。

2.2 動物體內(nèi)功效評價試驗

2.2.1 大鼠足趾腫脹試驗結(jié)果

與陰性對照組比較，陽性組及安溪肉桂提取物組在致炎后1 h開始對大鼠足趾腫脹有顯著的抑制作用（p＜0.05）。安溪肉桂提取物高劑量組（2 g/kg）于致炎后1 h開始即可顯著減輕大鼠足趾腫脹度，抗炎作用一直持續(xù)至致炎后6 h（p＜0.05）。安溪肉桂提取物低劑量組（0.5 g/kg）及中劑量組（1 g/kg）在致炎后2 h內(nèi)有明顯減輕足趾腫脹度的作用。由上述結(jié)果可以看出安溪肉桂提取物對蛋清所致的大鼠足趾腫脹有明顯的抑制作用。

2.2.2 大鼠棉球肉芽腫試驗結(jié)果

與陰性對照組比較，陽性組及安溪肉桂提取物組的肉芽腫重量有顯著性的下降（p＜0.05）。安溪肉桂提取物3個劑量均可極顯著地減輕大鼠肉芽腫重量（p＜0.01）。由上述結(jié)果可以看出安溪肉桂提取物對棉球所致的大鼠肉芽腫有明顯抑制作用。

表6 大鼠足趾腫脹試驗結(jié)果（±SD）Table 6 Results of paw edema experiment in rats(±SD)

表6 大鼠足趾腫脹試驗結(jié)果（±SD）Table 6 Results of paw edema experiment in rats(±SD)

注：與陰性對照組比較，* 表示差異顯著（p＜0.05），** 表示極顯著差異（p＜0.01），下同。Note:Compared with the negative control group，*indicated significance at p＜0.05，**indicated significance at p＜0.01，the same as followed.

致炎后6 h 6 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n s陰性對照組 8（1 6） - 0.6 6±0.1 9 0.6 1±0.1 7 0.4 9±0.2 0 0.4 0±0.1 7陽性對照組 8（1 6） 0.6 3 0.4 6±0.2 4** 0.4 6±0.1 6** 0.4 5±0.1 4 0.3 2±0.1 7組別T r e a t m e n t s動物數(shù)（足趾數(shù)）N u m b e r o f a n i m a l(n u m b e r o f t o e s)劑量（g/k g）D o s a g e致炎后不同時間足趾腫脹度（m L）R a t e o f r a t p a w e d e m a致炎后1 h 1 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n致炎后2 h 2 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n致炎后4 h 4 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n安溪肉桂提取物8（1 6） 0.5 0.5 2±0.1 7* 0.4 8±0.1 4* 0.4 6±0.1 6 0.3 4±0.1 6 8（1 6） 1 0.5 0±0.2 2* 0.4 0±0.1 5** 0.3 8±0.1 9 0.2 6±0.1 6*8（1 6） 2 0.4 7±0.1 6** 0.4 6±0.1 6* 0.3 8±0.1 6* 0.2 7±0.1 0*

表7 大鼠棉球植入試驗結(jié)果（±SD）Table 7 Results of cotton ball implantation experiment in rats(±SD)

表7 大鼠棉球植入試驗結(jié)果（±SD）Table 7 Results of cotton ball implantation experiment in rats(±SD)

肉芽腫重量（m g）N e t w e i g h t o f r a t g r a n u l o m a陰性對照組 8（1 6） - 1 3 8.1 8±6 3.2 4陽性對照組 8（1 6） 0.6 3 9 6.1 5±4 9.5 9*組別T r e a t m e n t動物數(shù)（肉芽腫數(shù)）N u m b e r o f a n i m a l劑量（g/k g）D o s a g e安溪肉桂提取物8（1 6） 0.5 9 0.3 2±3 1.7 1**8（1 6） 1 8 5.8 4±3 3.4 5**8（1 6） 2 7 0.0 5±3 3.1 7**

2.2.3 對血清炎癥因子的影響

與陰性對照組比較，陽性組及安溪肉桂提取物高劑量組（2 g/kg）的三種炎癥因子均有顯著性的下降（p＜0.05）。安溪肉桂提取物低劑量（0.5 g/kg）和中劑量（1 g/kg）未見此效果。由上述結(jié)果可以看出安溪肉桂提取物（2 g/kg）可顯著性地降低大鼠血清中的 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量（p＜0.05）。

表8 對大鼠血清炎癥因子的影響Table 8 Effect on serum inflammatory factors in rats

3 討論

王潤明[1]對0～7歲兒童咽部感染病原菌的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了肺炎鏈球菌、普通變形桿菌、大腸埃希氏菌等。同時，在對清熱顆粒、清熱利咽茶和對急慢性咽炎藥物的體外抑菌性研究中，均使用到了乙型溶血型鏈球菌、肺炎鏈球菌和普通變形桿菌[2-4]。因此，研究選用了乙型溶血型鏈球菌、肺炎鏈球菌和普通變形桿菌這三種菌作為受試菌種。在預試驗研究中發(fā)現(xiàn)，使用一般沖泡的方法進行提取獲得的提取液并沒有明顯的抑菌效果，因此隨后使用了有機試劑進行提取。較多研究發(fā)現(xiàn)，黃酮對普通變形桿菌[5-6]、肺炎鏈球菌[7-8]和乙型溶血性鏈球菌[9-10]都有良好的抑菌作用，且黃酮對乙型溶血性鏈球菌的抑菌性要優(yōu)于肺炎鏈球菌，盡管所測肉桂中茶多酚含量不高，但其良好的抑菌效果可能與其兒茶素組成及黃酮類物質(zhì)占比有關(guān)，具體結(jié)果還需要進一步驗證。

體內(nèi)外試驗說明安溪肉桂提取物具有較明顯的抗炎作用，具有干預急性炎癥（足趾腫脹）和慢性炎癥（肉芽腫形成）的作用，并能減少炎癥因子的產(chǎn)生。根據(jù)保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003版）可得出，動物試驗證明安溪肉桂茶具有一定的清咽保健功效，但還需要后續(xù)人體試食實驗來進一步驗證。