背角無(wú)齒蚌AwPrx4A基因克隆及在PFOS和PFOA脅迫下的表達(dá)分析

夏西超，張科，宋國(guó)英，馬向莉，宗玉霞，張明霞，李冰潔，于瑞雪，薛士鵬，劉慶春，華春秀，張慶遠(yuǎn)

1. 平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，平頂山 476000 2. 南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，南陽(yáng) 473061

全氟類化合物是一類以4～14個(gè)碳原子的烷基鏈為支架，氫原子被氟原子取代的具有高能C—F鍵的新型持久性有機(jī)污染物[1-2]。目前，全氟類化合物已被廣泛應(yīng)用于粘合劑、農(nóng)藥、阻燃劑、食品包裝盒、潤(rùn)滑劑、藥品、油漆、拋光劑、制冷劑和表面活性劑的生產(chǎn)過(guò)程中[1-2]。日常生活中，大量全氟類化合物從廢棄物中釋放到自然界中，并隨降雨導(dǎo)致地表水和地下水的污染。研究表明，環(huán)境中較為常見(jiàn)的是全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)和全氟辛酸(perfluoroocanoic acid, PFOA)，已對(duì)水生生物生存造成威脅，給整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)潛在的壓力[3-4]。雙殼類軟體動(dòng)物屬于濾食性動(dòng)物，常年居住于固定環(huán)境，很少移動(dòng)和遷徙，易于遭受水體重金屬和持久性有機(jī)染物的影響，使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，生成大量活性氧族(ROS)，給生物體造成脅迫[5]。生成過(guò)量的ROS能夠造成細(xì)胞電子傳遞鏈功能異常、線粒體出現(xiàn)呼吸爆發(fā)、生物大分子結(jié)構(gòu)的破壞。為了減少ROS生成，降低脅迫效應(yīng)，機(jī)體啟動(dòng)抗氧化酶系統(tǒng)的表達(dá)[6]。在這些酶中，硫氧化蛋白過(guò)氧化物酶(peroxiredoxin, Prx)是重要成員之一，Prxs可以將過(guò)氧化氫、有機(jī)過(guò)氧化物和過(guò)氧化合物分別轉(zhuǎn)化為水、乙醇和亞硝酸鹽[7]。Prx屬于保守的抗氧化蛋白家族，抗氧化作用顯著，廣泛存在于原核生物和真核生物中。動(dòng)物的Prx能夠發(fā)揮多種生物學(xué)功能，具有強(qiáng)大的抗氧化作用，在維持機(jī)體氧化還原平衡、細(xì)胞凋亡和增殖等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7]。背角無(wú)齒蚌(Anodontawoodiana)是雙殼類軟體動(dòng)物主要類群之一，已列入瀕危貝類物種，常作為淡水污染的指示性生物[8-9]。為了更好地保護(hù)淡水資源，對(duì)環(huán)境污染做出檢測(cè)，本研究從背角無(wú)齒蚌分離出AwPrx4A基因，分析PFOS和PFOA對(duì)其表達(dá)的影響，為揭示PFOS和PFOA脅迫效應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 背角無(wú)齒蚌處理

背角無(wú)齒蚌購(gòu)自南陽(yáng)市水產(chǎn)市場(chǎng)，PFOS(≥98%)、PFOA(96%)和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，TRIzol試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、菌株DH5α、克隆載體pMDl9-T、連接酶、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒和RACE試劑盒均購(gòu)自寶生物工程有限公司。其余常規(guī)藥品均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。背角無(wú)齒蚌殼長(zhǎng)(6.5±0.5) cm，在暴露實(shí)驗(yàn)之前，動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)水循環(huán)系統(tǒng)中適應(yīng)養(yǎng)殖2周，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，每次換水后投喂商品飼料。

半致死濃度(LC50)測(cè)定實(shí)驗(yàn)的濃度梯度取值采用等差或等比方法，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行設(shè)置，每個(gè)污染物設(shè)置5個(gè)濃度處理組，每組3個(gè)平行樣，每個(gè)平行10只動(dòng)物，以正常飼養(yǎng)組為空白對(duì)照組，進(jìn)行48 h急性毒性實(shí)驗(yàn)，每12小時(shí)觀察并記錄背角無(wú)齒蚌的死亡率，死亡標(biāo)準(zhǔn)以動(dòng)物外套膜松弛，長(zhǎng)時(shí)開(kāi)口，用玻璃棒輕觸外套膜緣5 min內(nèi)無(wú)反應(yīng)，及時(shí)撈出死亡個(gè)體并予以計(jì)數(shù)。

為了確定AwPrx4A組織分布，對(duì)來(lái)自同一塑料盒的6只動(dòng)物進(jìn)行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。PFOS和PFOA溶解于DMSO中以制備儲(chǔ)備液。動(dòng)物處理實(shí)驗(yàn)在長(zhǎng)方形塑料盒(40 cm×25 cm，高10 cm)中進(jìn)行，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[10]。動(dòng)物分為對(duì)照組、PFOS處理組(6.25、12.5、25、50和100 mg·L-1)和PFOA處理組(50、100、200、400和800 mg·L-1)，對(duì)照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過(guò)3‰。分別在0、6、12、24和48 h時(shí)每組取出6只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 背角無(wú)齒蚌AwPrx4A全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增

總RNA提取采用TRIzol試劑，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，將具有完整rRNA條帶的RNA用于合成cDNA，用M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應(yīng)模板。引物AwPrx4A1和AwPrx4A2參考三角帆蚌、褶紋冠蚌、長(zhǎng)牡蠣和爪蟾等物種的基因序列并采用DNAMAN軟件予以設(shè)計(jì)，合成后分離AwPrx4AcDNA保守區(qū)域片段，PCR產(chǎn)物連接至pMDT-19載體，雙向測(cè)序。確定AwPrx4A部分cDNA序列后，根據(jù)部分cDNA序列設(shè)計(jì)的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，擴(kuò)增AwPrx4AcDNA的5’和3’區(qū)域序列，對(duì)5’RACE和3’RACE的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和拼接。

1.3 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

分析AwPrx4A序列，通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索(www. ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行BLAST程序比對(duì)；根據(jù)http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP上所載信息預(yù)測(cè)信號(hào)肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用DANMEN分析程序?qū)wPrx4A基因進(jìn)行多序列比對(duì)；通過(guò)Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)AwPrx4A的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)；使用MEGA5.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 AwPrx4A mRNA水平定量檢測(cè)

為了確定AwPrx4A轉(zhuǎn)錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(寶生物工程有限公司)按照要求進(jìn)行定量分析。根據(jù)AwPrx4AF和AwPrx4AR引物序列，使用普通PCR儀分離靶基因(表1)，擴(kuò)增AwPrx4A基因片段長(zhǎng)度為180 bp，瓊脂糖凝膠電泳僅在檢測(cè)出的一個(gè)條帶上進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序和序列鑒別。β-actin作為內(nèi)參基因，使用ABI7500實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行real-time PCR測(cè)定；反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增效率為96.84%；構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)2-△△CT分析AwPrx4A表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used in quantitative real-time PCR

1.5 LC50數(shù)據(jù)分析

LC50=lg-1[Xm-i×(∑D-0.5)]

式中：LC50為半數(shù)致死濃度(μg·L-1)，Xm為污染物最大濃度的對(duì)數(shù)值，i為相鄰2組污染物濃度對(duì)數(shù)的差值，D為各組背角無(wú)齒蚌死亡率(%)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果(Results)

2.1 背角無(wú)齒蚌AwPrx4A分子結(jié)構(gòu)

背角無(wú)齒蚌AwPrx4AcDNA全長(zhǎng)由958個(gè)核苷酸組成，包含1個(gè)120 bp的5’非編碼區(qū)，1個(gè)412 bp的3’非編碼區(qū)和1個(gè)426 bp的開(kāi)放閱讀框(圖1)。開(kāi)放閱讀框?yàn)橛?42個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，分子量為16.87 kDa，等電點(diǎn)為4.97。SMART結(jié)果顯示，AwPrx4A包含還原酶結(jié)構(gòu)域(定位在5～155 aa)、烷基脫氫過(guò)氧化物還原酶亞基C、巰基特異性抗氧化結(jié)構(gòu)域(AhpC-TSA)(定位在6～139 aa)和C端硫氧化蛋白結(jié)構(gòu)域(定位在159～194 aa)(圖1)。

AwPrx4A推導(dǎo)的氨基酸序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列，包括Cys38、Cys48和Cys79共3個(gè)半胱氨酸殘基，第1個(gè)半胱氨酸殘基(IRFGHDWDPTCM)和第3個(gè)半胱氨酸(YLVDITEVPDFNKMYELYDPCT)在所有Prx4A序列中高度保守(圖2)。

AwPrx4A蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含5個(gè)α-螺旋和6個(gè)β-折疊(圖3(a))。AwPrx4A的3-D結(jié)構(gòu)與Prx4A家族成員高度相似(圖3(b))。

圖1 背角無(wú)齒蚌AwPrx4A基因的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列注：起始和終止密碼用粗體表示，終止信號(hào)“AATAAA”以波浪線顯示，半胱氨酸保守氨基酸以方框表示。Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AwPrx4A gene in Anodonta woodianaNote: The start and stop codons are indicated with bold; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with wavy line; the cysteime conserved domains is marked with box.

圖2 背角無(wú)齒蚌AwPrx4A與其他物種Prx4A序列多重比對(duì)注：半胱氨酸保守氨基酸殘基用下劃線表示。Fig. 2 Multiple alignment of AwPrx4A in Anodonta woodiana with other Prx4ANote: The conserved residues of cysteine are marked with underline.

圖3 背角無(wú)齒蚌AwPrx4A二級(jí)和3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)注：(a). AwPrx4A二級(jí)結(jié)構(gòu)；(b). AwPrx4A的3D結(jié)構(gòu)。Fig. 3 Predicted secondary and 3D structures of AwPrx4A deduced amino acids in Anodonta woodianaNote: (a). The secondary structure of AwPrx4A; (b). The 3D structure of AwPrx4A.

2.2 背角無(wú)齒蚌AwPrx4A進(jìn)化關(guān)系

BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，AwPrx4A與其他物種Prx4A成員關(guān)系密切，Prx4A與雙臍螺(Biomphalariaglabrata)同源性為94.39%，與黑指紋海兔(Aplysiadactylomela)同源性為93.67%，與長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)同源性為92.63%，與非洲爪蟾(Xenopuslaevis)同源性為90.51%，與旋毛蟲(chóng)(Trichinellanelsoni)同源性為86.43%。為了進(jìn)一步分析Prx4A其他Prx序列之間的進(jìn)化關(guān)系，用MEGA5.0系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，包括1-Cys、2-Cys和非典型2-Cys的Prxs。Prx1、Prx2、Prx3和Prx4群集于一個(gè)主類群中，構(gòu)成2-Cys類群。所有Prx6都聚集在一起，組成了一個(gè)類群。所有Prx5都形成了非典型的2-Cys子群。Prx4As聚集在一起形成一個(gè)獨(dú)立類群，與非典型2-Cys類群關(guān)系相對(duì)密切。在Prx4A類群中，AwPrx4A與軟體動(dòng)物包括海兔和雙肚臍螺的親緣關(guān)系最近，與人和其他物種親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖4)。

圖4 根據(jù)背角無(wú)齒蚌AwPrx4A氨基酸序列使用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic relationship of amino acid sequence of AwPrx4A between Anodonta woodiana and other organisms

2.3 背角無(wú)齒蚌AwPrx4A組織分布

Real-time PCR結(jié)果顯示，AwPrx4A在背角無(wú)齒蚌有廣泛的組織分布，包括斧足、外套膜、閉殼肌、心臟、肝細(xì)胞、血淋巴和鰓。AwPrx4A在肝胰腺中有較高的表達(dá)水平，在鰓、血淋巴、心臟和斧足為中等水平表達(dá)，在外套膜和閉殼肌表達(dá)水平相對(duì)較低(圖5)。

2.4 PFOS和PFOA的毒性效應(yīng)濃度

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，PFOS和PFOA對(duì)背角無(wú)齒蚌的LC50分別為28.388和192.083 mg·L-1(表2)。

2.5 PFOS和PFOA對(duì)背角無(wú)齒蚌肝胰腺AwPrx4A表達(dá)的影響

在濃度為6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS處理組中，肝胰腺中AwPrx4AmRNA水平的上調(diào)效應(yīng)呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴模式；與對(duì)照組相比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中，AwPrx4AmRNA水平在6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS處理組中分別增加了18.75%、2.85倍(P<0.05)、5.08倍(P<0.01)和5.52倍(P<0.01)以上(圖6)；與對(duì)照組相比，在100 mg·L-1的PFOS處理組，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中肝胰腺AwPrx4AmRNA水平增加了6.77倍以上(P<0.01)(圖6(a))。

圖5 背角無(wú)齒蚌AwPrx4A基因的空間表達(dá)注：每組數(shù)據(jù)來(lái)源于6只動(dòng)物，重復(fù)3次。Fig. 5 Real-time PCR analysis of AwPrx4A transcript levels from different tissues of Anodonta woodianaNote: The data are obtained from 6 animals, 3 replicates in each group.

與對(duì)照組相比，在50、100、200和400 mg·L-1的PFOA處理組中，AwPrx4AmRNA水平分別增加了20.83%、2.21倍(P<0.01)、2.25倍(P<0.01)和3.19倍(P<0.01)。在800 mg·L-1的PFOA處理組中，AwPrx4A的mRNA水平增加了5.64倍以上(P<0.01)(圖6(b))。

2.6 PFOS和PFOA對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓AwPrx4A表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中，背角無(wú)齒蚌鰓中AwPrx4AmRNA水平顯著增高。在濃度6.25、12.5、25、50和100 mg·L-1的PFOS處理組中，鰓中AwPrx4AmRNA水平分別增加了61.61%(P<0.05)、86.86%(P<0.05)、2.25倍(P<0.05)、2.75倍(P<0.01)和3.04倍(P<0.01)以上(圖7(a))。

與對(duì)照組相比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中背角無(wú)齒蚌鰓中AwPrx4AmRNA水平顯著增高。在濃度50、100、200、400和800 mg·L-1的PFOA處理組中，鰓中AwPrx4AmRNA水平分別增加了59.59%(P<0.05)、91.91%(P<0.05)、1.56倍(P<0.05)、2.62倍(P<0.01)和3.45倍(P<0.01)以上(圖7(b))。

2.7 PFOA和PFOA對(duì)背角無(wú)齒蚌血淋巴AwPrx4A表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中背角無(wú)齒蚌血淋巴中AwPrx4AmRNA水平顯示上調(diào)趨勢(shì)。在濃度6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平隨呈時(shí)間和劑量依賴性增高趨勢(shì)。在濃度6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平分別增加了47.42%、67.01%(P<0.05)、1.44倍(P<0.05)和2.43倍(P<0.01)以上。與對(duì)照組相比，在濃度為100 mg·L-1的PFOS處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平增加了2.67倍以上(P<0.01)(圖8(a))。

圖6 PFOS和PFOA對(duì)背角無(wú)齒蚌肝胰腺AwPrx4A基因表達(dá)的影響注：n=6/組/時(shí)間點(diǎn)；a、b表示與相應(yīng)對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 6 Temporal expression of AwPrx4A gene in hepatopancreas of Anodonta woodiana after PFOS and PFOA exposureNote: Data are expressed as means±SE; n=6/each group/each time point; a, b mean significant differences compared with the control at the same time (P<0.05, P<0.01).

表2 全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)對(duì)背角無(wú)齒蚌的48 h-LC50Table 2 48 h-LC50 values of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluoroocanoic acid (PFOA) to Anodonta woodiana

圖7 PFOS和PFOA對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓AwPrx4A基因表達(dá)的影響注：n=6/組/時(shí)間點(diǎn)；a、b表示與相應(yīng)對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 7 Temporal expression of AwPrx4A gene in gill of Anodonta woodiana after PFOS and PFOA exposureNote: Data are expressed as means±SE; n=6/each group/each time point; a, b mean significant differences compared with the control at the same time (P<0.05, P<0.01).

圖8 PFOS和PFOA對(duì)背角無(wú)齒蚌血淋巴AwPrx4A基因表達(dá)的影響注：n=6/組/時(shí)間點(diǎn)；a、b表示與相應(yīng)對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 8 Temporal expression of AwPrx4A gene in hemocytes of Anodonta woodiana after PFOS and PFOA exposureNote: Data are expressed as means±SE; n=6/each group/each time point; a, b mean significant differences compared with the control at the same time (P<0.05, P<0.01).

與對(duì)照組相比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中背角無(wú)齒蚌血淋巴中AwPrx4AmRNA水平顯著增高。在濃度50、100和200 mg·L-1的PFOA處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平呈時(shí)間和劑量依賴性增高趨勢(shì)。在濃度50、100和200 mg·L-1的PFOA處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平分別增加了20.61%、62.88%(P<0.05)和1.64倍(P<0.05)以上(圖8(b))。與對(duì)照組相比，在濃度為400和800 mg·L-1的PFOA處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平分別增加了1.97倍(P<0.01)和2.14倍(P<0.01)以上(圖8(b))。

3 討論(Discussion)

研究表明，AwPrx4A的3個(gè)半胱氨酸殘基分別位于蛋白序列38、48和79處，第1個(gè)和第3個(gè)半胱氨酸殘基分別位于2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域IRFGHDWDPTCM和YLVDITEVPDFNKMYELYDPCT中，提示AwPrx4A可能屬于2-Cys Prx類群成員。根據(jù)硫氧化蛋白過(guò)氧化物酶順序、結(jié)構(gòu)和功能特征，Prxs可分為3個(gè)主要類群：1-Cys、典型2-Cys和非典型2-Cys[11-12]。典型2-Cys型Prx由高度保守的2個(gè)半胱氨酸殘基組成，并形成二硫鍵，AwPrx4A中保守半胱氨酸殘基位置與典型2-Cys Prxs半胱氨酸所在位置高度重合[13-14]。研究證實(shí)，位于多肽鏈序列第1個(gè)半胱氨酸殘基與Prxs過(guò)氧化物酶活性有關(guān)，接受來(lái)自Arg128的氫鍵并將其提供給Glu55羧基。在3個(gè)半胱氨酸殘基中，第1個(gè)半胱氨酸殘基和第3個(gè)半胱氨酸殘基主要參與Prxs結(jié)構(gòu)中的二硫鍵形成，這是氧化反應(yīng)中間產(chǎn)物[15]。BLAST同源分析表明，AwPrx4A推導(dǎo)出的氨基酸序列與其他軟體動(dòng)物的Prx4A有超過(guò)50%的相似之處。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，AwPrx4A和Prx4A早期分化，具有明顯的獨(dú)立性，提示Prx4A可能是Prxs的一個(gè)新家族，需要在未來(lái)闡明其進(jìn)化特點(diǎn)和功能特性。

AwPrx4A在背角無(wú)齒蚌閉殼肌、肝胰腺、鰓、血淋巴、心臟和外套膜等中具有廣泛表達(dá)和分布，而且還分別表現(xiàn)出了特定表達(dá)譜和組織結(jié)構(gòu)特異性。廣泛組織分布與AwPrx4A在組織中保持細(xì)胞的氧化還原平衡有關(guān)。結(jié)果顯示，鰓中AwPrx4A表達(dá)水平最高，作為水生生物的呼吸器官，鰓能夠從水中獲取氧；鰓暴露在外部環(huán)境中，與環(huán)境中重金屬、有機(jī)污染物和病原微生物等直接接觸，是環(huán)境因子脅迫效應(yīng)的首要門(mén)戶，也是機(jī)體重要的免疫器官[16]。在選擇組織中，在肝胰腺和血淋巴中觀察到AwPrx4A有較高水平表達(dá)，這與肝胰腺和血淋巴作用有關(guān)；背角無(wú)齒蚌等軟體動(dòng)物依靠先天免疫實(shí)現(xiàn)環(huán)境耐受性，在此過(guò)程中，肝胰腺和血淋巴在參與集體氧化應(yīng)激和免疫耐受方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用。同時(shí)肝胰腺作為重要代謝器官，不斷地分解和合成各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及有毒有害物質(zhì)，細(xì)胞容易在代謝過(guò)程中遭受氧化應(yīng)激效應(yīng)，肝胰腺是對(duì)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵防線[17]。

本研究結(jié)果顯示，PFOS和PFOA對(duì)背角無(wú)齒蚌的LC50分別是28.388和192.083 mg·L-1，提示PFOS對(duì)背角無(wú)齒蚌環(huán)境毒性比PFOA更高。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PFOS和PFOA對(duì)水蚤的48 h-LC50分別35和476 mg·L-1，這表明不同類型PFCs毒性差異可能與自身結(jié)構(gòu)有關(guān)[1,18-19]。正常情況下，全氟類化合物對(duì)大多數(shù)生物標(biāo)志物的細(xì)胞毒性效應(yīng)通常會(huì)隨著氟原子數(shù)量增加而增強(qiáng)；對(duì)于同一處理濃度而言，毒性排序?yàn)镻FOA(C7)

研究發(fā)現(xiàn)，PFOS和PFOA處理后背角無(wú)齒蚌肝胰腺、鰓和血淋巴中AwPrx4A表達(dá)水平顯著增加，提示這可能與AwPrx4A可緩解機(jī)體氧化應(yīng)激并提高脅迫耐受性有關(guān)。背角無(wú)齒蚌屬于底棲淡水濾食性生物，PFOS和PFOA很容易在動(dòng)物進(jìn)食過(guò)程中在細(xì)胞內(nèi)累積下來(lái)，其中含有7個(gè)或更多氟原子的全氟化合物的累積過(guò)程會(huì)通過(guò)食物鏈呈現(xiàn)放大效應(yīng)[20-21]。在ROS壓力環(huán)境下，較高ROS濃度可能會(huì)增加DNA損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常的風(fēng)險(xiǎn)。提高抗氧化酶的活性，有助于減少ROS的損傷[20-21]。Prxs是一種抗氧化酶，在消除氧化應(yīng)激和增強(qiáng)免疫反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用[20-21]。在中國(guó)對(duì)蝦中注射細(xì)菌后，動(dòng)物血淋巴和肝胰腺中Prx4表達(dá)顯著提高用以減少ROS的生成和破壞[20]。在弧菌、白斑病病毒、過(guò)氧化氫和吲哚沙星等處理南美白對(duì)蝦后，Prx5表現(xiàn)水平顯著提高，增強(qiáng)其環(huán)境適應(yīng)能力[22]。與正常組相比，布魯氏菌感染后綿羊卵巢中Prx6轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，提高其病原耐受能力[23]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)處理后的小鼠體內(nèi)，Prx1基因表達(dá)被明顯誘導(dǎo)；細(xì)菌、病毒和LPS處理的大鼠，Prx3表達(dá)水平顯著上調(diào)，用以增強(qiáng)動(dòng)物免疫應(yīng)答能力。環(huán)境污染物、高溫、聚肌胞(PolyI:C)、細(xì)菌和病毒處理水生生物大菱魚(yú)后，Prx6可以被各種壓力因素誘導(dǎo)上調(diào)。由此可見(jiàn)，Prx家族基因上調(diào)與提高環(huán)境耐受能力和脅迫能力密切相關(guān)，PFOS和PFOA處理對(duì)AwPrx4A的上調(diào)效應(yīng)與背角無(wú)齒蚌對(duì)污染物脅迫抵抗能力的增強(qiáng)密切相關(guān)。

與脊椎動(dòng)物相比，軟體動(dòng)物免疫功能實(shí)現(xiàn)主要依靠先天免疫系統(tǒng)來(lái)完成。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和硫氧化蛋白過(guò)氧化物酶等一系列抗氧化酶在增強(qiáng)動(dòng)物的免疫調(diào)控能力中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在軟體動(dòng)物中，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，需要肝胰腺、鰓和血淋巴等多個(gè)器官參與。PFOS和PFOA處理后，背角無(wú)齒蚌肝胰腺、鰓和血淋巴中AwPrx4A表達(dá)水平顯著增加，這有助于清除機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)量ROS，提高細(xì)胞抗氧化能力，增強(qiáng)機(jī)體耐受性。