綠汁發(fā)酵液中的微生物多樣性及其對菌糠發(fā)酵品質(zhì)的影響

陳鑫珠, 高承芳, 劉 景*, 陳炳鈿, 黃勤樓, 黃秀聲, 翁伯琦*

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 福建 福州 350013； 2. 福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司博士后科研 工作站, 福建 福州 350008； 3. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)研究所, 福建 福州 350013)

21世紀(jì)以來，我國社會經(jīng)濟快速發(fā)展，飼料市場需求不斷提高，新型飼料開發(fā)顯得尤為重要[1]。近年來，我國食用菌的產(chǎn)量逐漸增加，使得菌糠(mushroom bran)的產(chǎn)量也隨之增加，這也使得開發(fā)菌糠飼料資源成為研究熱點[1]。青貯(silage)是將新鮮的牧草或秸稈等飼料作物，利用其表面附生的乳酸菌發(fā)酵成一種青綠多汁、耐貯存、可供動物全年均衡營養(yǎng)配方飼料的方法。國外對青貯研究的比較早，對一些青貯原料所含可溶性碳水化合物缺乏和附著在其上的乳酸菌數(shù)目不足是導(dǎo)致青貯失敗，開展了青貯劑的篩選、發(fā)酵效果及品質(zhì)評價等方面的研究[2]。綠汁發(fā)酵液(Fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria,FJLB) 是近年來新研發(fā)的一種新型生物性青貯添加劑，類似于乳酸菌制劑。其本質(zhì)是將植物勻漿后，利用其表面附生的乳酸菌在厭氧環(huán)境中將植物綠汁中的乳酸菌發(fā)酵富集，制成的一種青貯添加劑。其最大特點是經(jīng)濟和環(huán)保，制作工藝流程簡單、生產(chǎn)成本低、操作時安全，無污染，比一些商品乳酸菌制劑穩(wěn)定，且不受飼草生長季節(jié)、水分含量及發(fā)酵溫度的影響[3]。近年來，逐漸成為研究的熱點。在青貯料中添加綠汁發(fā)酵液可以迅速降低pH值，提高乳酸含量，抑制梭菌活動，減少低蛋白質(zhì)損失，且其添加效果不受青貯原料、DM含量及青貯條件影響[4]。添加綠汁發(fā)酵液可顯著地提高苜蓿青貯料的營養(yǎng)價值。Ohshima等[5]認(rèn)為，綠汁發(fā)酵液作用于苜蓿青貯不受收獲季節(jié)、生育期以及貯存溫度的影響，其青貯效果較好。但是，綠汁發(fā)酵液穩(wěn)定性較弱，不宜長期保存，在實際大規(guī)模生產(chǎn)中使用較少，其優(yōu)劣性還有待進一步研究。本試驗正是為探究影響其作用的微生物組成情況進行分析，為探究其穩(wěn)定性影響因素奠定理論基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)培養(yǎng)法是經(jīng)典的微生物研究方法，但是在分子生物技術(shù)快速發(fā)展的今天，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究微生物群落結(jié)構(gòu)、種群多樣性及變化有其局限性，費時和費力，且結(jié)果片面，無法充分解析樣品中微生物的種類、豐度及其變化情況，低估了微生物的多樣性[6]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和更新?lián)Q代，16S rRNA克隆建庫、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、脈沖電泳等方法也無法滿足科研分析的需要。基于微生物宏基因組學(xué)的高通量焦磷酸測序技術(shù)具有高通量、快速、省力等優(yōu)點，已逐漸被廣泛應(yīng)用于土壤、腸道、水體、發(fā)酵食品等各微生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性的檢測和研究，成為研究的熱點[7]。采用高通量測序技術(shù)檢測和分析綠汁發(fā)酵液中微生物多樣性還未有報道。因此，本試驗利用宏基因組學(xué)技術(shù)，研究不同綠汁發(fā)酵液中的微生物多樣性，為全面了解不同綠汁發(fā)酵液中的微生物組成情況、有益微生物種類、提高青貯飼料營養(yǎng)價值和品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)和新方法；另外，本試驗以菌糠為發(fā)酵原料，調(diào)制菌糠青貯飼料，為菌糠飼料的開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

菌糠：栽培平菇(Pleurotusostreatus)后的菌糠，由福建農(nóng)林大學(xué)菌草研究所提供。配方：五節(jié)芒(Miscanthusfloridulus(Labnll.)Warb)73% 麩皮25%，石灰2%，含水量60%。

紅象草(Pennisetumpurpureumred‘Red’)、甜玉米(ZeamaysL.)秸稈和葛藤(Puerarialobata(Willd.)Ohwi.)原料由泉頭牧草基地種植，甘蔗(Saccharumofficinarum)梢由市場購買的果蔗取末梢2～3節(jié)。

1.2 綠汁發(fā)酵液的制作

2015年7月20日紅象草(Red elephant grass，PEG)、甜玉米秸稈(corn stalk，CS)、菌糠(mushroom residue，MB)、葛藤(kudzu，K)和甘蔗梢(sugarcane top，SC)。綠汁發(fā)酵液的制備參照Bureenok等報道的方法[8]。每個材料制備3瓶綠汁發(fā)酵液，即3個重復(fù)。

1.3 菌糠青貯飼料的制作

將采集到的菌棒破膜、搗碎、混合均勻。稱取18份500 g菌糠原料，分別裝入30 cm×45 cm自封袋中，試驗自封袋貼好標(biāo)簽，分別均勻噴灑前期制作的五種綠汁發(fā)酵液(每種3個重復(fù)，共15份)，添加量為2 mL·kg-1綠汁發(fā)酵液+ 8 mL·kg-1蒸餾水，3份對照組處理噴灑等體積的蒸餾水，再充分混勻后裝入青貯袋中，抽真空、封口。放置室溫，發(fā)酵30開封。對照組和五種添加劑處理共6個處理18份，即每個處理3重復(fù)。

1.4 原料特性及發(fā)酵品質(zhì)的測定

原料分析樣本按常規(guī)方法測定水分和粗蛋白質(zhì)含量[9]；緩沖能的測定采用鹽酸、氫氧化鈉滴定法[10]；中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量的測定參照Van Soest方法[11]，半纖維素(hemicellulose，HC)=中性洗滌纖維-酸性洗滌纖維?？扇苄蕴妓衔?water soluble-carbohydrates，WSC)含量是用比色法[12]測定的。

分別采用MRS瓊脂培養(yǎng)基(MRS agar medium，MRS)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient Agar，NA)計數(shù)發(fā)酵液上的乳酸菌。乳酸菌用厭氧箱(YQX-Ⅱ型，上海新苗)，37℃培養(yǎng)2 d。

青貯料開封后，攪拌均勻，每個樣本稱20 g放入聚乙烯塑料封口袋中，加入80 mL蒸餾水，放置4℃冰箱浸泡18 h后離心，用pH計(pH計：pHS-3B，上海鵬順科學(xué)儀器有限公司)測上清液的pH值；準(zhǔn)確量取10 mL上清液，采用凱氏定氮儀測定氨態(tài)氮(NH3-N)含量[9]；采用島津LC-20AT型高效液相色譜儀測定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyrate acid，BA)含量。

WSC、NDF、ADF、HC、CP、LA、AA、PA和BA含量以干物質(zhì)基礎(chǔ)的百分比表示。

1.5 綠汁發(fā)酵微生物菌群分析

1.5.1綠汁發(fā)酵液總微生物菌體的收集將制備好的綠汁發(fā)酵液，搖勻后，取40 mL到滅菌后的離心管，1 000 rpm離心5 min，取上清液到另一只干凈的無菌管，12 000 rpm離心5 min，收集菌體沉淀。

1.5.2細(xì)菌基因組DNA的提取 每個菌體樣品按照FastDNA? SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，美國)試劑盒的說明，進行發(fā)酵液總細(xì)菌基因組DNA的提取，并用紫外分光光度計檢測其濃度和純度。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.5.316S rDNA的擴增和測序 使用上述提取的總DNA作為PCR的模板，利用特異性的引物對338F和 806R擴增細(xì)菌 16S rDNA基因序列高變區(qū)V3～V4區(qū)，同時在前引物 5’端添加Barcode序列區(qū)分樣品[13]。每個樣品 3次重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。16S rRNA基因測序文庫構(gòu)建和Illumina Miseq測序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.6.1生物信息學(xué)分析 序列分析由QIIME軟件包和UPARSE pipeline完成。首先原始序列通過QIIME的默認(rèn)參數(shù)過濾掉低質(zhì)量的序列；然后利用UPARSE軟件生成OTU(Operational Taxonomic Units)(序列相似度≥97%)，利用RDP從每個OTU中選擇一條序列作為OTU代表；根據(jù)獲得的OTU數(shù)據(jù)，以測序樣本的序列數(shù)為橫坐標(biāo)，OTU值作為縱坐標(biāo)繪出每個樣品的稀釋曲線，同時根據(jù)樣本中所共有和獨有的OTU數(shù)目作OTU分布圖。稀釋曲線及α-多樣性的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)等生物多樣性指數(shù)由mothur軟件平臺(version v. 1. 30. 1，http:/ /www. Mothur. org /wiki /Schloss _ SOP # Alpha _diversity)完成。熱圖(Heatmap)、主成分分析圖(PCA) 和冗余分析(RDA)采用R語言相關(guān)軟件包進行分析作圖。

1.6.2青貯數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用Excel對數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan法對均值進行多重比較，對材料特性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種原料的化學(xué)成分及微生物組成

五種原料的化學(xué)成分及微生物組成見表1。菌糠的干物質(zhì)含量和粗脂肪含量顯著高于(P<0.05)其他4種原料，緩存能和半纖維素含量顯著(P<0.05)低于其他4種原料；葛藤pH值、緩沖能、粗蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他4種原料，可溶性碳水化合物顯著(P<0.05)低于其他4種原料；甘蔗梢的半纖維素含量顯著(P<0.05)高于其他4種原料，粗脂肪含量顯著(P<0.05)低于其他4種原料；玉米秸稈和甘蔗梢的可溶性碳水化合物顯著(P<0.05)高于其他3種原料。5種原料微生物總量中，菌糠的乳酸菌、好氣性細(xì)菌、酵母菌和霉菌的數(shù)量顯著(P<0.05)低于其他4種原料。

表1 五種原料的化學(xué)成分及微生物組成Table 1 The chemical and microorganism composition of five materials

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同

Note:Different lowercase letter in the same column indicated significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.2 五種綠汁發(fā)酵液中的微生物OTU alpha多樣性分析

2.2.1五種綠汁發(fā)酵液中的多樣性指數(shù)分析 如圖1所示，Shannon稀釋曲線顯示曲線已經(jīng)趨于平坦，其覆蓋度均達(dá)到96%以上(表2)，表明樣本測序量已經(jīng)飽和，足夠反映樣本中絕大部分細(xì)菌物種的信息?；贠TU的結(jié)果，計算樣品的alpha豐富程度，葛藤和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液的OTU數(shù)量，葛藤綠汁發(fā)酵液的Chao1和ACE值顯著(P<0.05)高于玉米秸桿、紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液，葛藤和菌糠綠汁發(fā)酵液的Shannon值和npShannon值顯著高于玉米秸稈和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液，玉米秸稈和甘蔗梢的Simpson值顯著高于葛藤、紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液(表2)。葛藤綠汁發(fā)酵液的Chao1、ACE、Shannon和npShannon指數(shù)等指標(biāo)上均處在較高的水平，Simpson指數(shù)處在較低水平，說明葛藤綠汁發(fā)酵液的菌群數(shù)量較大，多樣性水平也相對較高。

圖1 樣品的shannon稀釋曲線圖Fig.1 Multy samples Shannon-wlener Curves注：corn，玉米秸稈；kudzu，葛藤；PEG，紅象草；MB，菌糠；SC，甘蔗梢；1，2，3，表示樣品的3個重復(fù)；下同Note:PEG,red elephant grass;MB,mushroom bran;SC,sugarcane;1,2,3 means three duplicates of the samples;The same as follow

表2 五種綠汁發(fā)酵液Alpha豐富程度表Table 2 The alpha diversity of five fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria

Number of OTUschao1ACEShannonnpShannonSimpsonCoverageCorn2711.33±58.18b6203.19±637.79c9622.11±943.20bc3.42±0.20c3.59±0.20c0.15±0.03a0.97Kudzu3580.67±74.14a7712.72±84.41a11865.80±303.76a4.02±0.25a4.19±0.27a0.10±0.02b0.96PEG2766.00±507.71b6258.08±1093.10bc9501.77±1573.24b3.86±0.09ab4.01±0.10ab0.09±0.02b0.97MB2877.33±230.97b6312.08±507.62bc9778.15±325.20b4.04±0.10a4.21±0.10a0.08±0.00b0.96SC3449.67±126.23a7405.40±37.40ab11128.47±146.83ab3.60±0.13bc3.77±0.12bc0.17±0.03a0.97F7.404.194.698.047.5810.02P0.010.030.020.000.000.00

2.2.2五種綠汁發(fā)酵液中微生物多樣性主成分分析 五種綠汁發(fā)酵液15個樣品的主成分分析見圖2。三個重復(fù)的樣品點聚集在一起，表示三個樣品重復(fù)性好。PC1的貢獻率為30.7%，PC2的貢獻率為25.9%。根據(jù)主成分分析，五組樣品大致可分為三類，紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液兩組樣品分別落在第一和第四象限，和其他組樣品的距離相對較遠(yuǎn)，單獨一類，甘蔗梢和玉米秸稈綠汁發(fā)酵液兩組樣品落在第二象限，葛藤落第三象限，三組樣品均分布在X軸附近，距離較近，歸類為一類。

圖2 樣品的PCA圖(OTU水平)Fig.2 Principal component analysis of microbial community of the samples (OUT level)

2.2.3五種綠汁發(fā)酵液中微生物多樣性熱圖分析 根據(jù)OTU的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，使用熱圖來展示不同的OTU在各樣品間的表達(dá)變化情況，同時可以根據(jù)熱圖上的聚類關(guān)系，也可以反應(yīng)樣本關(guān)系。因為OTU的數(shù)目較多，且多數(shù)OTU豐度都很低(包含tags數(shù)量為1)，所以我們使用OTU至少在一個樣本中包含tags數(shù)量達(dá)到總tags數(shù)量的0.1%作為閾值，對滿足該條件的OTU進行熱圖分析。圖3中五種綠汁發(fā)酵液的熱圖明顯呈現(xiàn)出五種原料微生物優(yōu)勢菌株的差異性。五種綠汁發(fā)酵液的3個重復(fù)均能較好的聚集在一起，說明樣品的重復(fù)性較好。玉米秸稈和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液首先聚為一類，說明其二者菌群相似度較高，之后再與葛藤聚為一類；紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液單獨聚為一類。

2.2.4五種綠汁發(fā)酵液中物種分類樹展示 根據(jù)物種的分類表達(dá)譜的數(shù)據(jù)，選取豐度較高的部分物種分類單元，我們做出了物種分類樹的展示圖。餅圖中不同的顏色的區(qū)域代表不同的樣品在該分類單元上的比率，半徑的大小代表該分類單元所包含的tag數(shù)占總tag的比例，半徑越大代表豐度越高，餅圖旁邊的百分比代表該分類單元的tag數(shù)占總tag數(shù)的百分比。

如圖4所示，綠汁發(fā)酵液微生物為細(xì)菌(99.804%)，主要為變形菌門(proteobacteria)(60.735%)的γ-變形菌綱Gamaproteobacteria(58.993%)和厚壁菌門(Firmicutes)(38.666%)的桿菌綱(Bacilli)(38.662%)。γ-變形菌綱主要是假單胞菌目(Pseudomonadales)(13.861%)下假單胞細(xì)菌科(Pseudomonadaceae)(13.475%)的假單胞屬(Pseudomonas)(11.952%)和腸桿菌目(Enterobacteriales)(43.846%)下腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(43.846%)的歐文氏菌屬(Erwinia)(7.556%)、克雷白氏桿菌屬(Klebslella)(12.128%)、沙雷氏菌屬(Serratia)(11.952%)、檸檬酸細(xì)菌屬(Citobacter)(1.467%)、沙門氏菌(Salmenella)(6.450%)和腸桿菌屬(Enterobacter)(0.303%)；桿菌綱主要是桿菌目(Lactobacillales)(38.075%)明串珠菌科(Leuconostocaceae) 的明串珠菌屬(Leuconostoc)(30.751%)和魏斯氏菌屬(Weissella)(1.45%)，以及鏈球菌科(Streptococcaceae)(7.153%)的乳球菌屬Lactococcus(7.117%)。其中玉米秸稈綠汁發(fā)酵液中克雷白氏桿菌屬和明串珠菌屬比例較高，菌糠綠汁發(fā)酵液中檸檬酸細(xì)菌屬、沙門氏菌和腸桿菌屬比例較高，葛藤和紅香草綠汁發(fā)酵液中乳球菌屬比例較高，另外葛藤綠汁發(fā)酵液中腸桿菌屬比例較高。

圖3 樣品OTU表達(dá)譜熱圖Fig.3 OTU heat map of samples

圖4 樣品菌群的發(fā)育樹Fig.4 Species classification tree of samples

2.3 不同水平下微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1基于目水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 五種綠汁發(fā)酵液基于目水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)見圖5(豐度>1%)。圖5顯示了15個樣本共鑒定出60個目，豐度大于1%的目只有4個，總豐度分別占98.47%(玉米秸稈)，97.43%(葛藤)，97.15%(紅象草)，96.82%(菌糠)和96.07%(甘蔗梢)，其中乳酸桿菌目(Lactobacillales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)為優(yōu)勢菌目，伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)在各組樣品中占的比例較低，另外還有一些無類別的(Unclassified)和其他(Other)細(xì)菌。不同原料所制得綠汁發(fā)酵液目水平的微生物分布比例差異明顯。玉米秸稈和紅象草綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢菌目為腸桿菌目和乳酸桿菌目，分別占48.34%和35.73%；葛藤綠汁發(fā)酵液中乳酸桿菌目、腸桿菌目和假單胞菌目三者為優(yōu)勢菌目，分別占35.52%、31.50%和29.61%；菌糠綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢菌目為腸桿菌目，占71.48%；甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢菌目為乳酸桿菌目，占59.07%，另外腸桿菌目其占25.89%。

圖5 基于目水平的樣本微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Microbial community structure of sample on the order level注：堆疊圖展示至少在一個樣本中的表達(dá)豐度達(dá)到1%的物種，達(dá)不到1%的物種統(tǒng)一歸類到Other類別中去，無法注釋到該水平的tags則被歸類到Unclassified類別中去；下同Note:The stack diagram shows the species that expression abundance reached 1%,the species less than 1% were classified into Other categories,the tags unable to comment are classified into the Unclassified category;The same as below

2.4.2基于科水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 五種綠汁發(fā)酵液基于科水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)見圖6(豐度>1%)。圖6顯示了15個樣本共鑒定出90個科，豐度大于1%的科只有4個，分別為明串珠菌科(Leuconostocaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)和鏈球菌科(Streptococcaceae)，另外還有一些無類別的(Unclassified)和其他(Other)細(xì)菌。4個科的菌總豐度分別為97.41%(玉米秸稈)，95.61%(葛藤)，95.89%(紅象草)，94.54%(菌糠)和93.28%(甘蔗梢)。不同原料所制得綠汁發(fā)酵液不同科水平的微生物分布比例有明顯差異。玉米秸稈綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢菌科為明串珠菌科和腸桿菌科，分別占32.86%和48.34%；葛藤綠汁發(fā)酵液中明串珠菌科、腸桿菌科和假單胞菌科三者為優(yōu)勢菌目，分別占34.70%、31.50%和28.90%；紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液中腸桿菌科為優(yōu)勢菌科，分別占53.02%和71.48%；甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢菌目為明串珠菌科，占59.07%，另外腸桿菌目其占25.89%。

圖6 基于科水平的樣本微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.6 Microbial community structure of sample on the family level

2.4.3基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 五種綠汁發(fā)酵液基于屬水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)見圖7(豐度>1%)。圖7顯示了15個樣本共鑒定出129個屬，豐度大于1%的屬有9個，分別為明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，另外還有一些無類別的(Unclassified)和其他(Other)細(xì)菌。9個屬菌總豐度分別為85.40%(玉米秸稈)，60.15%(葛藤)，77.74%(紅象草)，72.68%(菌糠)和42.31%(甘蔗梢)，葛藤和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中含有較大比例無法注釋的菌屬。不同原料所制得綠汁發(fā)酵液菌屬種類和分布比例有顯著差異。在可注釋的這些菌屬中，玉米秸稈綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢菌屬為明串珠菌屬(29.81%)、克雷白氏桿菌屬(31.96%)和假單胞菌屬(11.85%)，另外，與青貯相關(guān)的乳球菌屬占2.75%；葛藤綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬(26.82%)，明串珠菌屬(6.97%)、魏斯氏菌屬(2.21%)和沙門氏菌屬(1.80%)；紅象草綠汁發(fā)酵液中乳球菌屬(28.12%)和沙雷氏菌屬(23.08%)為優(yōu)勢菌屬，另外，與青貯相關(guān)的明串珠菌屬占10.17%；菌糠綠汁發(fā)酵液優(yōu)勢菌屬為沙門氏菌屬占31.71%，另外，與青貯相關(guān)的明串珠菌屬占6.09%；甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中50%以上菌屬無法注釋，含有與青貯相關(guān)的菌屬有明串珠菌屬(9.43%)、乳球菌屬(3.44%)和魏斯氏菌屬(2.71%)。

2.4 五種綠汁發(fā)酵液對菌糠發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.4.1五種綠汁發(fā)酵液對菌糠發(fā)酵料干物質(zhì)、氨態(tài)氮和pH的影響 五種綠汁發(fā)酵液對菌糠干物質(zhì)、氨態(tài)氮和pH的影響見圖8。各處理組干物質(zhì)含量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，菌糠綠汁發(fā)酵液處理組的干物質(zhì)含量顯著(P<0.05)高于紅象草、葛藤和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液組；與對照組相比，菌糠綠汁發(fā)酵液處理組的氨態(tài)氮含量顯著(P<0.05)降低；與對照組相比，五種綠汁發(fā)酵液組的pH顯著(P<0.05)降低，紅象草綠汁發(fā)酵液處理組的pH顯著(P<0.05)低于其他處理組。

2.4.2五種綠汁發(fā)酵液對菌糠發(fā)酵料有機酸的影響 五種綠汁發(fā)酵液對菌糠發(fā)酵料有機酸的影響見圖9。與對照組相比，五種綠汁發(fā)酵液處理組青貯料的乳酸含量顯著(P<0.05)升高，丁酸含量顯著(P<0.05)降低；除紅象草綠汁發(fā)酵液處理組外，其他四種綠汁發(fā)酵液處理組的乙酸含量顯著(P<0.05)降低；紅象草綠汁發(fā)酵液處理組的丙酸含量顯著(P<0.05)降低。

圖7 基于屬水平的樣本微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.7 Microbial community structure of sample on the genus level

圖8 五種綠汁發(fā)酵液對干物質(zhì)含量、氨態(tài)氮含量和pH值的影響Fig.8 The effect of five fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria on dry matter content,ammonia-N content and pH value注：CK，對照組；PEG，紅象草綠汁發(fā)酵液處理組；Corn，玉米綠汁發(fā)酵液處理組；MB，菌糠綠汁發(fā)酵液處理組；Kudzu，葛藤綠汁發(fā)酵液處理組；SC，甘蔗梢綠汁發(fā)酵液處理組；不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同Note:CK,control;PEG,adding red elephant grass fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria (FJLB) group;MB,adding mushroom bran FJLB group;Kudzu,adding kudzu FJLB group;SC,adding sugarcane FJLB group;Different lowercase letter indicated significant difference at the 0.05 level (P<0.05);The same as below

圖9 五種綠汁發(fā)酵液對有機酸的影響Fig.9 The effect of five fermented juice of epiphytic LAB on the contents of organic acid

2.5 冗余分析

采用冗余分析綠汁發(fā)酵液乳酸菌菌屬與青貯發(fā)酵產(chǎn)物的相關(guān)性等結(jié)果見圖10。pH、氨態(tài)氮坐落在第一現(xiàn)象，與分布在第一象限的腸球菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬呈銳角，為正相關(guān)；丁酸在第二象限，與分布在第二象限和第三現(xiàn)象的片球菌屬和明串珠菌屬呈銳角，為正相關(guān)，且射線較長，相關(guān)系數(shù)較高；乳酸和乙酸在第三象限，與分布在第三象限的明串珠菌屬、Y軸負(fù)半軸的鏈球菌屬和第四象限的乳球菌屬呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較高；干物質(zhì)和丙酸分布在第四象限，與Y軸負(fù)半軸的鏈球菌屬和第四象限的乳球菌屬呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較高。

采用冗余分析綠汁發(fā)酵液乳酸菌菌種與青貯發(fā)酵產(chǎn)物的相關(guān)性等結(jié)果見圖11。腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的射線最長，對青貯有機酸的影響最大。丁酸和乳酸在第一象限，與腸系膜明串珠菌呈銳角，為正相關(guān)；氨態(tài)氮在第二象限，靠近X軸負(fù)半軸，與附近的嗜酸球菌(Pedococcusacidilactici)、干酪腸球菌(Enterococcuscasselillvus)、細(xì)辛腸球菌(Enterococcusasini)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、葡萄魏氏菌(Weissellaviridescens)和格氏乳球菌(Lactococcusgarviease)呈銳角，為正相關(guān)；pH在第三現(xiàn)象，與第三象限上的嗜酸球菌、干酪腸球菌、細(xì)辛腸球菌、短乳桿菌、葡萄魏氏菌、硫腸球菌(Enterococcussulfureus)和格氏乳球菌呈銳角，為正相關(guān)；干物質(zhì)、乙酸和丙酸在第四象限，與無乳鏈球菌呈銳角，為正相關(guān)。

圖10 屬水平上的RDA分析Fig.10 RDA analysis on the genus level

圖11 種水平上的RDA分析Fig.11 RDA analysis on the specie level

3 討論

青貯主要是利用原來中的乳酸菌進行厭氧發(fā)酵，使的青貯料成為一個酸性環(huán)境，而酸性環(huán)境能夠有效抑制有害微生物的生長繁殖，從而保存原料的營養(yǎng)物質(zhì)[14-17]。許多原料附生的乳酸菌數(shù)量較少，添加乳酸菌制劑是人工擴大青貯原料中乳酸菌群體的有效方法[18-19]。本次試驗結(jié)果表明，試驗原料菌糠中的乳酸菌數(shù)量較少，僅2.23 lg cfu·g-1FM。一般來說，使乳酸菌迅速增殖并占主導(dǎo)地位的原料中，乳酸菌的有效濃度以105·g-1鮮草為標(biāo)準(zhǔn)值[20]。本試驗菌糠原料遠(yuǎn)低于這個標(biāo)準(zhǔn)值，因此必須采用人工添加乳酸菌制劑的方法進行發(fā)酵。綠汁發(fā)酵液是人工制成的一種新型的純天然的青貯添加劑。Naoki[4]，Ohshima[21]等報道在青貯料中添加綠汁發(fā)酵液可以迅速降低青貯料的pH值，提高乳酸含量，抑制梭菌活動，減少蛋白損失，且其添加效果不受青貯原料、收獲季節(jié)、生育期、干物質(zhì)含量及青貯條件影響，其青貯效果較好。鄭丹等[22]表明，添加綠汁發(fā)酵液后促進同質(zhì)乳酸菌的發(fā)酵，有效地抑制了丁酸菌及其他有害微生物活性，減少了蛋白質(zhì)的分解，提高了乳酸菌對水溶性碳水化合物的利用效率及雜交狼尾草青貯發(fā)酵品質(zhì)。本試驗也獲得相似結(jié)果，五種綠汁發(fā)酵液能夠有效的改善菌糠的發(fā)酵品質(zhì)，提高菌糠青貯料的乳酸含量，降低了其pH值、乙酸含量和丁酸的含量。這與Shao[23]在黑麥草中，許慶芳[24]等在苜蓿中，葉杭等[25]香蕉葉中添加綠汁發(fā)酵液的效果相似。

綠汁發(fā)酵液其實質(zhì)是人工培養(yǎng)法對原料表面附生的乳酸菌在無氧條件下進行自然富集，因此可作為乳酸菌菌劑的替代物。Cai等報道[26]，與青貯密切相關(guān)的乳酸菌主要是乳桿菌屬(Lactobacillus)，片球菌屬(Pediococcus)，腸球菌屬(Enterococcus)，明串珠菌屬(Leuconostoc)，乳球菌屬(Lactococcus)，鏈球菌屬(Streptococcus)，魏斯特菌屬(Weissella)。這些菌屬中的菌株能夠在厭氧條件下，進行乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸，降低青貯料的pH值，從而抑制一些需氧的不良細(xì)菌的生長繁殖，保存青貯料的營養(yǎng)物質(zhì)。本試驗對菌屬與青貯發(fā)酵品質(zhì)進行關(guān)聯(lián)性分析的冗余分析結(jié)果中射線較長，與菌糠青貯發(fā)酵關(guān)系較大的是菌屬為片球菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬和乳球菌屬。高通量測序結(jié)果中，玉米秸稈綠汁發(fā)酵、葛藤綠汁發(fā)酵液、紅象草綠汁發(fā)酵液、菌糠綠汁發(fā)酵液和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中相關(guān)的菌株占得比例為32.56%(明串珠菌屬29.81%和乳球菌屬2.75%)、9.18%(明串珠菌屬6.97%和魏斯氏菌屬2.21%)、38.29%(乳球菌屬28.12%和明串珠菌屬10.17%)、6.09%(明串珠菌屬6.09%)和15.58%(明串珠菌屬9.43%、乳球菌屬3.44%和魏斯氏菌屬2.71%)，這個結(jié)果中紅象草綠汁發(fā)酵液中與青貯有關(guān)的乳酸菌屬占的比例最高，在紅象草綠汁發(fā)酵液液中占據(jù)了絕對優(yōu)勢的比例，這應(yīng)該是其在6個處理組中獲得最低pH值和最高的乳酸含量，效果最佳的主要原因。綠汁發(fā)酵液中含有許多有其他菌屬的細(xì)菌，其中歐文氏菌屬為兼性好氣菌，代謝為呼吸型或發(fā)酵型，pH值5.3～9.2均可生長，最適pH值 7.2；克雷白氏菌屬為兼氣性厭氧菌，若pH值低于6.0或高于8.0則生長緩慢；沙門氏菌，為兼性厭氧，最佳pH值為6.5～7.5；沙雷氏菌屬為兼性厭氧，幾乎所有的菌株能在pH 5～9下生長[27]。這些菌株均為兼性厭氧，在發(fā)酵初期會與青貯相關(guān)的乳酸菌進行競爭，只有當(dāng)青貯料的pH降到5.0以下時，其生長才被抑制，因此，這些菌占比例較大時，其添加效果就不穩(wěn)定，具體體現(xiàn)在玉米秸稈綠汁發(fā)酵液中，其與青貯有關(guān)的乳酸菌占32.56%的比例，但僅克雷白氏桿菌屬占31.96%，因此無法突出乳酸菌優(yōu)勢菌群的效果。而假單胞菌屬，這些菌專性需氧的革蘭氏染色陰性無芽胞、有莢膜桿菌，不發(fā)酵糖類，pH值低于5.0或高于9.0則基本不生長[27]，因此其對青貯發(fā)酵影響不大，并且這些菌屬許多為專性需氧菌，在厭氧條件下其生長被抑制[28]，而與青貯相關(guān)的乳酸菌為厭氧菌，在厭氧的條件的，能夠迅速生長繁殖，迅速提高其在發(fā)酵料中的的比例，正面影響青貯發(fā)酵進程。這可能就是葛藤綠汁發(fā)酵液中，雖然假單胞菌屬占最高比例，是葛藤綠汁發(fā)酵液的優(yōu)勢菌，但葛藤綠汁發(fā)酵液的添加效果卻僅次于紅象草綠汁發(fā)酵液的原因。近年來，一些報道表示綠汁發(fā)酵液的使用存在不穩(wěn)定，通過本試驗結(jié)果可表明，其主要原因是其中與青貯相關(guān)的乳酸菌屬所占比例較低，其他兼性厭氧菌屬占比例較高造成的。冗余分析的結(jié)果也證明，正是這些菌屬的不同，造成青貯品質(zhì)的差異。本試驗中，在綠汁發(fā)酵液中，嗜酸球菌、干酪腸球菌、細(xì)辛腸球菌、短乳桿菌、葡萄魏氏菌和格氏乳球菌等菌株與青貯料的pH值和氨態(tài)氮有密切的相關(guān)性，這些菌株在乳酸菌商品添加劑中較為常用的菌株，已經(jīng)有較肯定的效果，然而腸系膜明串珠菌和無乳鏈球菌與對青貯發(fā)酵產(chǎn)物中的乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的產(chǎn)生有較大的相關(guān)性，目前對這兩株菌在青貯的的應(yīng)用研究較少報道，需進一步深入研究。

4 結(jié)論

5種綠汁發(fā)酵液均能夠顯著提高青貯料的乳酸含量，顯著降低青貯料的丁酸含量，提高菌糠青貯料的發(fā)酵品質(zhì)。不同原料制備的綠汁發(fā)酵中微生物種群分布有明顯差異，在青貯發(fā)酵中，效果不完全不同。本試驗五種綠汁發(fā)酵液中，紅象草綠汁發(fā)酵液與青貯相關(guān)的乳酸菌比例最高，在6個處理組中獲得最低pH值和最高的乳酸含量，效果最佳。通過Miseq高通量測序技術(shù)分析，能夠清楚的解析綠汁發(fā)酵液中微生物的分布情況，闡明綠汁發(fā)酵液中微生物的分布與青貯料品質(zhì)的關(guān)系。