蜂巢珊瑚共生真菌的分離、鑒定及其抗氧化活性

王蘭英，韓丹丹，鄧 恒，駱焱平

(海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228)

自由基是引起生物細胞衰老的重要因素。過量的自由基可以給生物帶來脂質(zhì)過氧化、膜損傷、酶失活和DNA鏈的斷裂等危害?？寡趸镔|(zhì)可以通過消除自由基使得生物機體免受損傷，因此抗氧化研究是當今生物研究領(lǐng)域的熱點[1]。隨著海洋微生物活性的不斷挖掘，其抗氧化活性研究也逐漸引起科研人員的關(guān)注。如Sun等[2]從海洋中分離的絲狀真菌Keissleriellasp.YS4108具有明顯的清除超氧陰離子和羥基自由基的活性；閻雪芬等[3]采用化學(xué)發(fā)光法篩選獲得7株對活性氧具有抑制作用的深海真菌，其中有3株對羥基自由基和過氧化氫有較好的清除能力；Sun等[4]從一株海洋真菌的發(fā)酵液中分離的次生代謝產(chǎn)物顯示出良好的體外抗氧化活性，尤其是清除超氧陰離子自由基能力較為突出。可見，從海洋中分離具有抗氧化活性的微生物切實可行。海洋生物的共生微生物與寄主有密切的關(guān)系，共生微生物可分泌種類豐富、生物活性多樣的次生代謝產(chǎn)物[5]，如珊瑚共生的微生物菌株能夠產(chǎn)生酚酸類、生物堿、聚酮、黃酮、萜類等化合物，這些化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[6-7]。但是關(guān)于珊瑚共生抗氧化研究鮮有報道，因此開展珊瑚共生真菌抗氧化研究具有重要意義。

蜂巢珊瑚是指群體似蜂巢狀的塊狀珊瑚，其個體一般為對角形，個體之間由1～4個相通的壁孔連接，體壁薄，不甚發(fā)育[8]。蜂巢珊瑚是中國雷州半島徐聞西南海岸石珊瑚優(yōu)勢種之一[9]。該類珊瑚因孔率少，致密度高，適合作為人工骨的材料[10]。肖勝藍等[11]對蜂巢珊瑚附生真菌種類進行調(diào)查，但關(guān)于該類珊瑚共生微生物抗氧化活性的研究未見報道。本研究從蜂巢珊瑚中分離共生真菌，篩選抗氧化活性較好的菌株，對其進行鑒定，為尋找新型抗氧化類藥物的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試珊瑚 蜂巢珊瑚樣品采自海南省西沙群島。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，海水1 L，瓊脂16 g。海水取自?？谑邪咨抽T附近海域。

1.1.3 主要試劑 DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)，ABTS[2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]，均為分析純。真菌基因組提取試劑盒購自索萊寶生物公司。引物ITS1和ITS4由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 樣品處理及菌株分離

樣品處理：用滅菌海水清洗珊瑚表面3次，稱取2 g珊瑚樣品置于滅菌研缽內(nèi)研磨至泥漿狀，放入50 mL錐形瓶中，加入20 mL滅菌海水， 120 r/min振蕩30 min，靜置20 min，取其上清液1 mL加入9 mL滅菌海水依次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5g/mL。每個質(zhì)量濃度梯度樣品取100 μL置于PDA培養(yǎng)基中，用滅菌涂布棒涂布均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～10 d，待菌落長出，挑取菌落邊緣獲得純化菌株。純化菌株接種到試管斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存，待用[12]。

1.3 真菌發(fā)酵液的制備

將純化菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，待菌株長到培養(yǎng)皿面積的2/3時，平板中加入3 mL滅菌海水，用滅菌涂布棒刮取真菌孢子，收集孢子懸浮液用無菌紗布過濾除去菌絲，在顯微鏡下利用血球計數(shù)板計數(shù)，然后用滅菌海水稀釋孢子懸浮液至107CFU/mL。配制馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)分裝于250 mL三角瓶中，每瓶裝樣量為100 mL，120 ℃滅菌20 min，待培養(yǎng)液冷卻后接入上述孢子懸浮液1 mL，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，獲得菌株發(fā)酵液。將發(fā)酵液室溫下5 000 r/min離心15 min，取上清液作為待測液，備用。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 高價鐵離子還原作用 將硫酸亞鐵FeSO4配制成不同濃度梯度的溶液，以亞鐵離子濃度(mol/L)為橫坐標(x)，以波長593 nm的吸光度作為縱坐標(y)，繪制硫酸亞鐵標準曲線。參考Du等[13]的方法配制Ferric reducing ability of plasma(FRAP)溶液，取0.1 mL待測液與3.0 mL FRAP溶液混合，37 ℃恒溫水浴5 min，取出后迅速混勻，測量混合液在波長593 nm的吸光度，通過硫酸亞鐵標準曲線計算出混合液中硫酸亞鐵濃度，評價供試菌株對高價鐵離子還原能力。

1.4.2 DPPH自由基清除作用 參考Bouaziz 等[14]的方法并且稍作修改：用φ=95%乙醇配制2×104mol/L DPPH溶液，在離心管中加入0.5 mL提取液及3.5 mL DPPH溶液，常溫下孵育30 min，混勻后在波長517 nm測量吸光度，記為As；用φ=95%乙醇代替樣品測定吸光度，記為Ab。DPPH清除率計算公式如下：

DPPH清除率=(Ab-As)/Ab×100%

1.4.3 ABTS自由基清除作用 參考Thoo等[15]方法測定ABTS自由基清除率： 配制ABTS自由基溶液(取10 mL 7 mmoL/L ABTS溶液，加入10 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，混合后黑暗靜置16 h，用φ=95%乙醇將其稀釋至波長734 nm吸光度為0.7±0.02，黑暗密封，備用)，取0.1 mL待測提取液加入3.9 mL ABTS自由基溶液，反應(yīng)6 min混合均勻后在波長734 nm測量吸光度，記為As；用0.1 mLφ=95%乙醇代替樣品測吸光度，記為Ab。ABTS自由基清除率計算公式如下：

ABTS清除率=(Ab-As)/Ab×100%

1.5 S-1-5菌株的鑒定

1.5.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察 將供試菌株接種于PDA，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后觀察菌落特征；采用插片法觀察菌絲及孢子形態(tài)[16]。

1.5.2 菌株生長速率測定 將供試菌株接種至PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h采用十字交叉法測量菌落直徑，連續(xù)測量5 d，計算菌落平均生長速率。

1.5.3 真菌的分子生物學(xué)鑒定 將菌株S-1-5接種至PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，無菌條件下刮取菌絲置于滅菌研缽，加液氮研磨至粉末狀。按照真菌基因組DNA提取試劑盒(D2300，索萊寶科技有限公司，中國)中說明書進行菌絲基因組提取，以提取的基因組 DNA 為模板，采用真菌 ITS rDNA 基因通用引物 ITS1/ITS4 擴增，引物序列為：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[17]。對核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ITS 進行 PCR 擴增；PCR 反應(yīng)體系為50 μL：雙蒸水33 μL，PCR Buffer ( 含 Mg2+) 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，10 μmol/L的引物 ITS1 與 ITS4 各 1 μL，DNA 模板 5 μL，DNATaqpolymerase (10 U) 1 μL。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃，3 min；進入循環(huán)： 94 ℃，45 s； 57 ℃，45 s； 72 ℃，75 s，35個循環(huán)；72 ℃，10 min。取 5 μL PCR 產(chǎn)物，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，利用goldview(10 000×，索萊寶科技有限公司，中國)染色，凝膠成像儀(GelDocXR，BIO-RAD，美國)檢測。PCR 產(chǎn)物的序列測定由上海生工有限公司完成。

對菌株S-1-5的 ITS rDNA 基因序列，利用NCBI中BLAST進行同源性比對，選出與該序列相似性較高的核酸序列。使用Mega(ver.6.0)軟件，采用鄰接法(Neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過自舉分析(Bootstrap) 進行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次[18]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計軟件 SPSS (ver.22.0)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性測定

2.1.1 高價鐵離子還原能力 測得FeSO4標準曲線為y=0.063x+0.020 3，R2為0.998 4，方程相關(guān)性好，可信度高。測定各菌株發(fā)酵液對高價鐵還原能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測試的9株真菌的總體高價鐵還原能力較強(圖1)，經(jīng)菌株發(fā)酵液處理后，混合液中Fe2+濃度均在70 mol/L以上，尤其菌株S-1-5對高價鐵離子還原能力最強，經(jīng)其發(fā)酵液處理后混合液中Fe2+濃度可達132.016 mol/L。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0. 05)，下同 Different lowercase lettters mean significant difference(P<0.05)，the same below

圖1菌株的高價鐵離子還原作用
Fig.1Ferric-reducingantioxidantpowerofisolates

2.1.2 DPPH清除率測定 二苯基苦味肼基自由基DPPH是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在波長517 nm有最大吸收。不同菌株發(fā)酵液對DPPH清除能力的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試菌株發(fā)酵液，均有一定的抗氧化作用(圖 2)，其中菌株S-1-5對DPPH的清除能力最強，清除率為70.60%，與其他菌株相比顯著差異；其次菌株S-1-2 對DPPH也有較好的清除能力，清除率為52.32%，其余真菌發(fā)酵液對DPPH清除率均低于30%。

2.1.3 ABTS清除率 ABTS自由基清除率廣泛應(yīng)用于體外抗氧化活性測定，在反應(yīng)體系中，ABTS經(jīng)過氧化后可以生成相對穩(wěn)定的藍綠色的ABTS自由基，溶液發(fā)生褪色、特征吸光值降低。不同菌株發(fā)酵液對ABTS自由基清除能力的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試菌株對ABTS自由基均有一定的清除能力(圖3)，其中菌株S-1-5對ABTS的清除能力最強，清除率為67.18%，與其他菌株相比顯著差異；其次菌株S-1-6、S-1-8和S-1-3對ABTS也有較好的清除能力，清除率>50%；相比較之下菌株S-1-1、S-1-2、S-1-4、S-1-7和S-1-9清除能力稍差，清除率<50%。

圖2 菌株的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging capacity of isolates

圖3 菌株的ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS radical scavenging capacity of isolates

2.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

對菌株S-1-5培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該菌株菌落形態(tài)不規(guī)則；菌絲短小而致密，初期菌落黃綠色，菌落邊緣淡黃色，后期菌落顏色加深為土黃色，菌落邊緣墨綠色(圖4-A)，菌落背后有黑色皺褶(圖4-B)。該菌株分生孢子呈橢圓形(圖4-C)，分生孢子梗具多隔膜，呈竹節(jié)狀(圖4-D)，菌絲分支少(圖4-F，4-G)。菌株S-1-5平均生長速率為0.56 cm/d。該菌落特征與分生孢子形態(tài)與Zalar等[19]報道的枝孢屬球孢枝孢Cladosporiumsphaerospermum基本一致。

A.菌株S-1-5培養(yǎng)菌落正面 The surface of colonies of isolate S-1-5 on PDA medium；B.菌株S-1-5培養(yǎng)菌落背面 The backside of colonies of isolate S-1-5 on PDA medium；C.分生孢子 Conidia；D.分生孢子梗放大 Enlargement of conidiophores；E.菌絲及分生孢子梗 Mycelia and conidiophores；F.菌絲放大 Mycelial morphology；G.菌絲形態(tài) Enlargement。標尺為30 μm Bar=30 μm

圖4菌株S-1-5的菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)學(xué)觀察
Fig.4MorphologicalobservationsofcoloniesandconidiaofisolateS-1-5

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株S-1-5的ITS r DNA序列長度為525 bp，將此序列提交GenBank注冊，獲得登錄號為MG787259。運用NCBI database中在線Blast比對發(fā)現(xiàn)，菌株S-1-5與枝孢屬(Cladosporium)種類的序列同源性較高。利用 MEGA(Ver.6.05)軟件構(gòu)建基于rDNA-ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，菌株S-1-5與球孢枝孢(C.sphaerospermum，GenBank accession No:MF061765)的進化距離最近。結(jié)合該菌株菌落特征及分生孢子形態(tài)特征，將菌株S-1-5 鑒定為枝孢屬球孢枝孢(C.sphaerospermum)。

圖5 基于ITS rDNA序列同源性構(gòu)建的菌株S-1-5 18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of isolate S-1-5 based on 18S rDNA sequence homology

3 討 論

共生微生物是指微生物附著在其他生物上，與被附生生物協(xié)同生存的一類微生物。許多研究指出，這類微生物對于被附生生物的生存起著極為重要的作用，如海綿共生微生物可為海綿形成一種化學(xué)防御屏障抵御有害附著物、病原微生物危害[20]；珊瑚共生微生物可參與珊瑚生物合成，防御外來生物的入侵以及增強珊瑚的抗逆性[21-22]。本研究從蜂巢珊瑚中分離獲得的一株共生真菌S-1-5具有較強地消除自由基的能力。過量的自由基可以給生物帶來脂質(zhì)過氧化、膜損傷、酶失活和DNA鏈的斷裂等危害。因此，通過清除自由基以保護被附生生物機體免受損傷可能是附生微生物防御外來生物入侵的重要機制之一。肖勝藍等[11]對徐聞珊瑚保護區(qū)的8種珊瑚進行共生真菌的調(diào)查指出，蜂巢珊瑚附生真菌的優(yōu)勢屬為枝孢屬。本研究對分離于蜂巢珊瑚的菌株S-1-5鑒定為枝孢霉屬球孢枝孢?？梢?，菌株S-1-5可能是蜂巢珊瑚生存過程中重要的枝孢屬種類。

海洋共生真菌的活性次生代謝產(chǎn)物的研究已有報道。人們普遍認為，海洋共生真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物具有種類豐富、結(jié)構(gòu)新穎、活性高等特點[23-26]。因此，對海洋共生微生物的深入研究可為解決海洋產(chǎn)物含量低及藥源不足等問題帶來希望，是開發(fā)海洋新型藥物和尋找海洋動植物替代資源的重要途徑[27]。陳艷麗[28]從直針尖柳珊瑚共生真菌(Penicilliumcommune)發(fā)酵液中獲得一種具有抗氧化活性的物質(zhì)，經(jīng)鑒定該物質(zhì)為胞外多糖類，該結(jié)構(gòu)的多糖首次從珊瑚中獲得，具有開發(fā)為海洋糖類藥物的潛在價值。本研究發(fā)現(xiàn)分離自蜂巢珊瑚的菌株S-1-5發(fā)酵液具有很強的抗氧化活性，但未對其活性物質(zhì)進一步分離。鑒于珊瑚共生真菌潛在的生防價值，在后續(xù)研究中有必要對菌株S-1-5活性成分進行分離、鑒定，為開發(fā)海洋微生物活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。