喹啉高效降解菌株Alcaligenes sp. WUST-qu的篩選、鑒定及降解特性

劉建忠，易紅磊，翟 赟，黃 皓，陳 俊，周 衛(wèi)，秦曉蓉

(武漢科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,武漢 430081)

喹啉及其衍生物是一類重要的工業(yè)原材料和溶劑，廣泛存在于煤焦油、頁(yè)巖、石油等物質(zhì)中[1-2]，用途包括醫(yī)藥、染料、油漆、木材加工等行業(yè)。喹啉在醫(yī)藥上主要用于制造煙酸系、8-羥基喹啉系和奎寧系三大類藥物，其中的代表之一就是為眾人所熟知的、全球廣泛使用的抗瘧疾特效藥奎寧。與之同時(shí)，喹啉及其衍生物又是一類典型的環(huán)境污染物，具有難降解、有毒、致畸甚至致癌的作用。研究表明，4-硝基喹啉-1-氧化物不僅會(huì)對(duì)小麥和蠶豆的發(fā)芽率、出苗率和苗高有明顯的抑制作用，而且會(huì)誘發(fā)其根尖細(xì)胞染色體發(fā)生畸變[3-4]，該物質(zhì)還能誘發(fā)大鼠舌黏膜發(fā)生癌變[5]。

微生物生物技術(shù)用于環(huán)境污染的治理具有生態(tài)友好和經(jīng)濟(jì)有效等特點(diǎn)，已成為現(xiàn)代工業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要技術(shù)保障之一。篩選能高效降解一種或幾種特定有機(jī)污染物的菌株，并添加到活性污泥中以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定污染物高效降解的生物強(qiáng)化作用具有重要意義[1-2,6]。本研究從武漢某焦化廠污水處理系統(tǒng)曝氣池的活性污泥中篩選到一株喹啉高效降解菌，并對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分類地位、降解特性和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 活性污泥的采集

用于分離目標(biāo)菌株的活性污泥采集自武漢某焦化廠污水處理系統(tǒng)曝氣池，具體做法為采用長(zhǎng)柄勺舀曝氣池面上0～20 cm處的活性污泥，盛入事先準(zhǔn)備好的塑料桶，帶回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)處理。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基包括LB液體培養(yǎng)基，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(Mineral salt medium,MSM)，MSM固體/斜面培養(yǎng)基，微量元素培養(yǎng)液等，其各自的成分和配制參照文獻(xiàn)[7]完成，經(jīng)高壓滅菌后待用。

1.3 菌種的富集、馴化和分離

采用文獻(xiàn)[8]介紹的篩選苯酚降解菌的方法完成菌種的富集、馴化和分離。

1.4 菌株的革蘭氏和芽孢染色

參照文獻(xiàn)[7]完成。

1.5 掃描電鏡樣品的制備及觀察

用于掃描電鏡觀察的樣品經(jīng)戊二醛(2.5%)固定、磷酸鹽緩沖溶液洗滌(3次，每次5 min)、體積分?jǐn)?shù)依次增加的乙醇脫水 (20%，50%，70%，85%，95%，100%；每體積分?jǐn)?shù)下脫水10 min)、叔丁醇置換2～3次(φ=100%，每次10 min)、真空干燥40～60 min，噴金觀察。掃描電鏡為Nova 400 NanoSEM，F(xiàn)EI(美國(guó))，工作電壓為15 kV。

1.6 菌株16S rRNA基因部分核苷酸序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

菌株16S rRNA基因部分核苷酸序列由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司測(cè)定。擴(kuò)增所使用的引物的核苷酸序列為：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約為1 400 bp。使用BLAST程序?qū)γ绹?guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rRNA基因核苷酸序列進(jìn)行搜索，并使用“分子進(jìn)化遺傳分析(MEGA 5.0)”軟件分析序列，應(yīng)用ClustalW算法進(jìn)行逐對(duì)和多重序列比對(duì)，利用鄰接法(Neighbour-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.7 菌體生物量、喹啉和苯酚質(zhì)量濃度的測(cè)定

菌體生物量是采用分光光度計(jì)(UV-2000，日本)測(cè)定培養(yǎng)液于600 nm處的吸光值，并通過(guò)事先建立的菌體干質(zhì)量與OD600的校正曲線進(jìn)行計(jì)算；喹啉的測(cè)定方法是比色法，參比為不含喹啉的MSM，測(cè)定波長(zhǎng)為277 nm；苯酚的測(cè)定采用4-氨基安替吡啉法，參比為不含苯酚的MSM，測(cè)定波長(zhǎng)為510 nm。

1.8 種子液的制備

在500 mL三角瓶中，加入質(zhì)量濃度為500 mg·L-1的喹啉/苯酚的MSM 200 mL，接入1 mL 菌株WUST-qu培養(yǎng)液，在中性pH和37 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，直到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50 mL離心管，以 8 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min以回收菌體，用20 mL MSM重新懸浮沉淀，以相同的條件離心回收菌體，重復(fù)2次。以適量MSM重懸沉淀，并將懸液的OD600調(diào)整至1.0，以之為降解試驗(yàn)中的種子液，接種量為培養(yǎng)液總體積的5%。

1.9 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

測(cè)定每個(gè)喹啉質(zhì)量濃度下不同時(shí)間的生物質(zhì)質(zhì)量濃度，通過(guò)對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)期的生物質(zhì)質(zhì)量濃度與培養(yǎng)時(shí)間的半對(duì)數(shù)作圖做線性最小二乘回歸(Linear least-square regression)，擬合出菌體的比生長(zhǎng)速率；采用軟件 Origin 8.0，將菌株的比生長(zhǎng)速率與對(duì)應(yīng)的底物質(zhì)量濃度進(jìn)行非線性最小二乘擬合得到Haldane方程中的各參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及鑒定

經(jīng)過(guò)連續(xù)的富集、馴化和梯度稀釋涂布添加500 mg·L-1喹啉的MSM瓊脂平板，獲得55個(gè)單菌落，經(jīng)在添加相同質(zhì)量濃度喹啉的MSM瓊脂平板上劃線純化后，將每一菌落分別于MSM斜面培養(yǎng)基和添加φ=20%甘油的MSM中于-80 ℃保存。之后對(duì)獲得的所有菌落逐一進(jìn)行以喹啉為唯一碳源的搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，編號(hào)為Qu-12的菌株顯示突出的喹啉降解能力，將其命名為WUST-qu，并用于后續(xù)的研究。該菌株革蘭氏、芽孢染色結(jié)果如圖1和圖2所示，掃描電鏡放大20 000倍和50 000倍的結(jié)果如圖3所示。

圖1 菌株WUST-qu革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 The Gram stain of the bacterial strain WUST-qu

圖2 菌株WUST-qu芽孢染色結(jié)果Fig.2 The spore stain of the bacterial strain WUST-qu

圖3 菌株WUST-qu的掃描電鏡圖(A.20 000倍,B.50 000倍)Fig.3 The scanning electron microscope image of bacterial strain WUST-qu (A.20 000×; B.50 000×)

由圖1可見(jiàn)，菌株經(jīng)革蘭氏染色后呈粉紅色，表明該菌株為革蘭氏陰性菌；由圖2可見(jiàn)，菌株經(jīng)芽孢染色后呈綠色，表明該菌株產(chǎn)芽孢。由圖3可見(jiàn)，該菌株呈典型的桿狀菌的特征，長(zhǎng)為1.15 μm±0.08 μm，寬為0.26 μm±0.01 μm，無(wú)可見(jiàn)的鞭毛。菌株WUST-qu 16S rRNA基因部分核苷酸序列 (1 435 bp)已提交到GenBank，登錄號(hào)為MF099860。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果表明，該菌株16S rRNA基因與產(chǎn)堿桿菌屬菌株M14和JASI的同源性均高達(dá)99%，故將該菌株鑒定為產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenesfaecalis)，采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖4所示。

圖4 基于16S rRNA基因核苷酸序列同源性構(gòu)建的菌株WUST-qu系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of bacterial strain WUST-qu based on the nucleotide homology of its 16S rRNA gene

2.2 菌株WUST-qu在不同初始pH降解喹啉的特征

環(huán)境pH是影響受污染地點(diǎn)生物修復(fù)效果的重要因素之一，因而測(cè)定菌株WUST-qu在不同初始pH降解喹啉的降解特征。菌株WUST-qu于MSM初始pH為5.0～9.0時(shí)降解不同初始質(zhì)量濃度喹啉的特征以及在降解過(guò)程中生物質(zhì)增長(zhǎng)的特征如圖5所示。

由圖5可見(jiàn)，MSM初始pH為5.0時(shí)，菌株WUST-qu能在24、30、36和60 h之內(nèi)分別將初始質(zhì)量濃度為100、200、300和400 mg·L-1的喹啉完全降解，在降解不同初始質(zhì)量濃度的喹啉時(shí)均呈現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)延滯期(12～30 h)，延滯期有隨喹啉初始質(zhì)量濃度提高而延長(zhǎng)的趨勢(shì)；與MSM初始pH為5.0相比，MSM初始pH為6.0時(shí)，酸性環(huán)境對(duì)菌株WUST-qu所產(chǎn)生的脅迫作用明顯減弱，菌株降解喹啉的活力得到明顯提升。能夠完全降解喹啉的最高質(zhì)量濃度由之前的400 mg·L-1提升到600 mg·L-1，完全降解低質(zhì)量濃度喹啉所需要的時(shí)間明顯縮短，延滯期也有所縮短，但對(duì)于初始質(zhì)量濃度為600 mg·L-1的喹啉，菌株依舊呈現(xiàn)出較長(zhǎng)的生長(zhǎng)延滯期(30 h)；中性pH明顯有利于菌株WUST-qu對(duì)喹啉的降解，能夠在接種后48 h內(nèi)將初始質(zhì)量濃度為700 mg·L-1的喹啉完全降解，700 mg·L-1是該菌株能夠完全降解喹啉的最高質(zhì)量濃度，菌體生長(zhǎng)的延滯期較之pH 5.0和6.0時(shí)大為縮短；菌株WUST-qu在MSM初始pH為8.0時(shí)降解不同初始質(zhì)量濃度喹啉和在降解過(guò)程中生物質(zhì)的變化特征與MSM初始pH為7.0時(shí)如出一轍，不再贅述。這在很大程度上表明，中性或者略偏堿性(7.0～8.0)是該菌株降解喹啉的理想pH范圍；MSM初始pH為9.0時(shí)，菌株WUST-qu降解初始質(zhì)量濃度為600 mg·L-1以下的喹啉都尚屬順暢，只是完全降解初始質(zhì)量濃度為600 mg·L-1的喹啉所需的時(shí)間較初始pH為7.0時(shí)延長(zhǎng)6 h，而完全降解初始質(zhì)量濃度為700 mg·L-1的喹啉所需的時(shí)間則大幅度延長(zhǎng)24 h之多。菌體生物質(zhì)增長(zhǎng)特征與初始pH為7.0時(shí)相比，差異很小，最明顯的差異莫過(guò)于初始喹啉質(zhì)量濃度為700 mg·L-1的試驗(yàn)組的延滯期延長(zhǎng)30 h之多，但一旦越過(guò)延滯期之后，菌體生物質(zhì)呈指數(shù)增長(zhǎng)，與之相伴隨的是喹啉被快速降解。

圖5 菌株WUST-qu在MSM初始pH為5.0～9.0、降解不同初始質(zhì)量濃度喹啉時(shí)的降解曲線和生物量的增長(zhǎng)曲線Fig.5 The biodegradation and biomass growth curves of bacterial strain WUST-qu degrading quinoline at different initial mass concentrations at initial pH of between 5.0-9.0

2.3 菌株WUST-qu降解苯酚的特征

關(guān)于菌株WUST-qu底物廣譜性的研究表明，該菌株不僅能夠有效降解喹啉，還能有效降解苯酚。菌株于MSM初始pH為8.0，于35 ℃和150 r·min-1的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)時(shí)，降解不同初始質(zhì)量濃度苯酚以及在降解過(guò)程中生物質(zhì)的增長(zhǎng)特征如圖6所示。

由圖6可見(jiàn)，菌株WUST-qu能夠在8、20、24和32 h之內(nèi)分別將初始質(zhì)量濃度為100、300、500和700 mg·L-1的苯酚完全降解，但即便是降解初始質(zhì)量濃度僅為100 mg·L-1的苯酚，菌株WUST-qu也顯示出4 h的延滯期，而且隨著苯酚初始質(zhì)量濃度的提高，延滯期逐漸延長(zhǎng)。

2.4 菌株WUST-qu以喹啉為唯一碳源時(shí)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

菌株比生長(zhǎng)速率與喹啉初始質(zhì)量濃度的關(guān)系如圖7所示。

圖6 MSM初始pH為8.0時(shí)菌株WUST-qu降解不同初始質(zhì)量濃度苯酚時(shí)的降解曲線和生物量的增長(zhǎng)曲線Fig.6 The biodegradation and biomass growth curves of bacterial strain WUST-qu degrading phenol at different initial mass concentrations at initial pH of 8.0

從圖7可見(jiàn)，比生長(zhǎng)速率先是隨著喹啉初始質(zhì)量濃度的提高而增加，到達(dá)某一質(zhì)量濃度后(即到達(dá)Sm值后)， 隨喹啉質(zhì)量濃度的升高而降低，最大比生長(zhǎng)速率對(duì)應(yīng)的喹啉質(zhì)量濃度為55.545 mg·L-1。其他參數(shù)如下：μmax= 1.657 6 h-1，Ks= 36.42 mg·L-1，Ki= 81.418 mg·L-1，R2= 0.968。

3 討 論

本研究報(bào)道的菌株WUST-qu能夠完全降解喹啉的最高質(zhì)量濃度為700 mg·L-1，雖不及鄭中原等[9]和Sun等[2]的結(jié)果，但高于絕大多數(shù)公開(kāi)報(bào)道的結(jié)果[1,10-11]。這些較低的數(shù)值與喹啉在水中的溶解性較差有關(guān)，也充分反映出喹啉的難降解性；與其同屬含氮雜環(huán)化合物的吡啶，能與水以任意比例互溶，文獻(xiàn)[12]報(bào)道的微生物能夠完全降價(jià)吡啶的濃度高達(dá)70 mmol·L-1(質(zhì)量濃度5 537 mg·L-1)。關(guān)于微生物降解喹啉的機(jī)理，已有很多有益的探索。不同種屬的微生物降解喹啉的途徑可能不盡相同，但大的方面是一致的。概括的途徑是喹啉經(jīng)兩次羥基化，產(chǎn)物分別為2-羥基喹啉和2,8-二羥基喹啉，后者被轉(zhuǎn)化為8-羥基香豆素和3-(2,3-二羥基苯基)丙酸，并進(jìn)一步被礦化為CO2和H2O。在本研究中，也采用GS/MS對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，檢測(cè)到2-羥基喹啉的存在，但沒(méi)有檢測(cè)到其他代謝中間產(chǎn)物。

圖7 菌株比生長(zhǎng)速率與喹啉初始質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.7 The relationship between the specific growth rates of the bacterial strain and the initial mass concentrations of quinoline

盡管菌株WUST-qu也能有效降解苯酚，但其降解效率卻不及筆者之前篩選到的以降解苯酚為目標(biāo)的菌株P(guān)seudomonassp. WUST-C1[8]，后者能在接種后4 h和32 h內(nèi)將初始質(zhì)量濃度分別為200 mg·L-1和為1 200 mg·L-1的苯酚完全降解，而且在降解較低質(zhì)量濃度的苯酚(< 400 mg·L-1)時(shí)不表現(xiàn)出延滯期。有研究表明[13]，在有氧條件下，微生物降解苯酚的第一步是在羥化酶的作用下，將苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，隨后，鄰苯二酚通過(guò)鄰位或間位裂解途徑開(kāi)環(huán)。而喹啉微生物降解的起始也包含兩步連續(xù)的羥基化，并進(jìn)而轉(zhuǎn)化為2,8-二羥基喹啉。這種代謝途徑上的相似性是解釋菌株WUST-qu既能有效降解喹啉又能有效降解苯酚可能的機(jī)理之一。

生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)知識(shí)對(duì)于了解微生物降解喹啉的能力是極其重要的。Haldane動(dòng)力學(xué)方程常用于描述抑制性底物在純培養(yǎng)或混合培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)速率。為了獲得菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，測(cè)定喹啉初始質(zhì)量濃度為50～700 mg·L-1時(shí)不同時(shí)間的生物質(zhì)質(zhì)量濃度，通過(guò)線性最小二乘回歸擬合出菌體的比生長(zhǎng)速率，通過(guò)非線性最小二乘擬合得出Haldane方程中的μmax、Ks和Ki值。Zhu等[10]采用Haldane模型研究一株紅球菌屬菌株QL2以喹啉為底物生長(zhǎng)時(shí)的動(dòng)力學(xué)，獲得的相關(guān)參數(shù)分別為：μmax= 0.499 h-1，Ks= 68.7 mg·L-1，Ki= 387.1 mg·L-1；李靜等[14]報(bào)道一株嗜酸菌屬菌株降解喹啉的Haldane動(dòng)力學(xué)參數(shù)：μmax= 0.640 h-1，Ks= 164 mg·L-1，Ki= 253 mg·L-1。本研究中的菌株WUST-qu的最大比生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)高于Zhu等[10]和李靜等[14]報(bào)道的結(jié)果，這意味著WUST-qu可以在含高質(zhì)量濃度喹啉的工業(yè)廢水中快速生長(zhǎng)，并因此迅速降解喹啉，顯示出在應(yīng)對(duì)喹啉污染突發(fā)事件中較大的應(yīng)用潛力。