利用SSR分子標記技術(shù)快速鑒定雜交油菜天禾油10號純度

朱哲逸 張彩娟 徐青青 朱宗河

摘? 要：以甘藍型油菜天禾油10號及其父母本為材料，利用SSR分子標記方法對天禾油10號雜交制種待測樣品進行了鑒定分析。結(jié)果表明，利用引物CB10036、CN48鑒定待測樣品144棵單株，純度為67.08%，同批次待測樣大田種植鑒定純度為70.2%，兩種方法鑒定結(jié)果基本一致，說明引物CB10036、CN48可用于天禾油10號的室內(nèi)純度快速鑒定。

關(guān)鍵詞：油菜;SSR分子標記技術(shù);天禾油10;純度

中圖分類號 S565.4文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）04-0016-03

中國是油菜生產(chǎn)大國，種植總面積和總產(chǎn)均占世界30%左右[1]。甘藍型雜交油菜超親優(yōu)勢明顯，達20%～30%[2]，其群體純度即雜種群體的非雜種植株的多少，是影響群體產(chǎn)量的重要因素之一[3]。為降低雜交油菜制種風險，需要快速、準確、有效地鑒定雜交油菜品種的純度[4]。雜交油菜品種傳統(tǒng)的純度鑒定方法主要是大田種植鑒定[5]，但完全依據(jù)大田種植鑒定需要異地種植，周期較長[6]。采用同工酶技術(shù)鑒定雖然鑒定時間較短，但難以區(qū)分親緣關(guān)系較近的雜交種[7]。由于SSR標記鑒定技術(shù)能體現(xiàn)出同一位點在不同個體之間的多態(tài)性，并且數(shù)量豐富，擴增穩(wěn)定，擴增譜帶少，易于檢測，具有共顯性、重復(fù)好、多態(tài)性豐富以及簡單快捷易于掌握等特點，近年來已大量用于雜交油菜的純度鑒定中[8-19]。本研究探索利用SSR分子標記技術(shù)對國審雜交油菜品種天禾油10號大田生產(chǎn)的雜交種純度進行鑒定，輔助田間種植鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為國審油菜品種天禾油10號及其親本不育系5C650和恢復(fù)系R161。親本種子及天禾油10號雜交種由天禾科技集團股份有限公司提供。

1.1.1 取樣 雜交種天禾油10號純度待測樣取自安徽和縣制種田，制種田于2016年9月播種，收獲前在代表性制種田采取“Z”形選取樣株。各取樣株主軸、一次分枝、二次分枝角果數(shù)按1∶1∶1取樣，每株取12個角果，共取1000個角果。取樣角果45℃烘箱烘干后脫粒后，所取純度待測樣種子混勻后一分為二，1份于2017年5月15日帶到青海進行種植鑒定，1份發(fā)芽后進行室內(nèi)SSR純度鑒定。室內(nèi)鑒定于2017年12月至2018年2月在安徽農(nóng)業(yè)大學生物科技樓進行。

1.1.2 引物來源 SSR引物和DNA聚合酶購自上海生工，引物序列源于中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《甘藍型油菜品種鑒定技術(shù)標準SSR標記法》（NY/T 2468-2013）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 在12cm×12cm×6cm的發(fā)芽盒中放2層發(fā)芽紙，噴蒸餾水充分濕潤發(fā)芽紙，在發(fā)芽紙上均勻點上親本及雜交種，光照發(fā)芽箱室溫下發(fā)芽7d。選取150株雜交種幼苗，分單株提取DNA，各取5個父、母本單株的幼嫩子葉混合磨樣后提取DNA。DNA提取方法參照陸光遠等的CTAB法[20]。

1.2.2 擴增反應(yīng) 將-20℃保存的雜交種及親本DNA稀釋至30ng·μL-1進行PCR擴增。10μLPCR反應(yīng)體系為：DNA1μL，dNTPs0.1μL，含Mg2+緩沖液1μL，Taq酶0.1μL，上下游引物各0.5μL，加超純水至10μL。體系配置完成后加入甘油封口，PCR按如下程序進行：94℃、5min;1個循環(huán);94℃、1min;60℃、30s，每循環(huán)降0.5℃;72℃、45s，以上梯度進行10個循環(huán);94℃、1min;55℃、30s;72℃、45s以上梯度進行30個循環(huán);最后72℃、8min;4℃保存。

1.2.3 擴增產(chǎn)物檢測 擴增產(chǎn)物4℃冷藏備用。SSR擴增產(chǎn)物加1/2體積的變性上樣緩沖液，95℃變性5min后立即冷卻，然后在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠上85W恒功率電泳1.5h。電泳結(jié)束后，變性凝膠用10%冰醋酸溶液固定、水洗，并用0.1%的硝酸銀溶液染色，1.5%NaOH溶液顯色，再用10%冰醋酸溶液終止顯影，漂洗并風干，拍照并記錄擴增條帶結(jié)果。

1.2.4 SSR純度鑒定 按照種子純度計算公式P（%）=C/T×100（P為純度，C為同時具有雙親特征譜帶的樣本數(shù)，T為待測樣品植株總數(shù)。統(tǒng)計并計算雜效種純度，比較SSR純度鑒定與大田種植鑒定的結(jié)果，確定SSR純度鑒定的有效性

1.2.5 田間種植鑒定 田間種植鑒定于2017年5—8月在青海省海東市平安區(qū)安徽省北繁中心試驗地進行。鑒定樣播20行/區(qū)，2m/行，每行播100粒種子，按同樣密度及播量播種少量標準雜交種作對照，生產(chǎn)期間不間苗。在盛花期，調(diào)查不育株及與標準雜交株有明顯區(qū)別的異型株。田間鑒定純度（%）=（待測樣調(diào)查總株數(shù)一不育株數(shù)-異型株）×100/待測樣調(diào)查總株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選 使用《甘藍型油菜品種鑒定技術(shù)標準SSR標記法》（NY/T 2468-2013）中47對SSR引物對天禾油10號標準雜交種及其親本進行PCR擴增，篩選出2對在標準雜交種的父母間差異明顯并在雜交種呈現(xiàn)出清晰雙親互補特征條帶的引物（見表1），用于天禾油10號雜交種的純度快速檢測。

2.2 SSR鑒定結(jié)果 根據(jù)待測雜交種及親本的擴增結(jié)果，統(tǒng)計同時具有雙親特征譜帶的樣本株數(shù)。引物CB10036擴增的單株有效株數(shù)為143株，其中同時具有雙親特征譜帶的真雜種樣本株數(shù)為91株;根據(jù)純度計算公式，計算出天禾油10號雜交種的純度為63.64%，引物CN48擴增的單株有效株數(shù)為142株，其中同時具有雙親特征譜帶的真雜種樣本株數(shù)為100株;計算天禾油10號雜交種的純度為70.42%。2對引物鑒定天禾油10號的平均純度為67.08%。

2.3 田間種植鑒定結(jié)果 大田調(diào)查945株，其中雜交種有663株，母本自交種282株，根據(jù)純度計算公式計算，雜交種的純度為70.2%，假雜種全部為母本自交種子。

3 討論與結(jié)論

為簡化雜交油菜SSR純度室內(nèi)鑒定的程序，本研究未進行SSR引物篩選，而是從油菜SSR核心引物中隨機選擇了CB10036和CN48這2對引物對天禾油10號的父母本及雜交種進擴增，結(jié)果表明，2對隨機選擇引物都能準確區(qū)分出待測樣中的真雜種及混雜的父母本，2對引物擴增結(jié)果都具有很好的一致性，且2對引物鑒定天禾油10號待測樣純度鑒定結(jié)果也相近。說明SSR標記有穩(wěn)定的共顯性，可以用來鑒定甘藍型油菜的雜交種。

通過對天禾油10號純度的室內(nèi)SSR鑒定與田間種植鑒定的結(jié)果進行比較可知，2種方法用于天禾油10號的純度鑒定結(jié)果基本一致，都可以用于天禾油10號的純度鑒定。室內(nèi)SSR鑒定能將待測樣真雜種中混雜的父本、母本、異品種通過擴增條帶與真雜種區(qū)別開來，而田間種植鑒定，通常只鑒定待測樣中的母本株，因此同一待測樣純度室內(nèi)SSR鑒定結(jié)果往往略低于田間種植鑒定。

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（責編：張宏民）