胃癌患者手術(shù)前后miRNA-101、miRNA-21表達(dá)水平及其臨床意義

張觀朝，徐兵，陳智年

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院普通外科，河南新鄉(xiāng)453000 0

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤中，發(fā)病率居第5位，病死率居第3位，且呈逐年增高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年發(fā)現(xiàn)的非編碼內(nèi)源性小分子RNA，負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄，研究顯示，miRNA與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，miRNA-101在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，是一種抑癌miRNA[2]。研究認(rèn)為，miRNA-101可通過(guò)作用于髓系細(xì)胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）基因而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。miRNA-21在多種惡性腫瘤中表達(dá)存在明顯異常，多項(xiàng)研究顯示miRNA-21在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[4-5]。本研究擬采用實(shí)時(shí)熒光定量方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)miRNA-101、miRNA-21在胃癌患者中的表達(dá)水平，旨在探討胃癌可能的發(fā)病機(jī)制及潛在的治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年6月至2017年12月新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院診治的胃癌患者的病歷資料。所有患者均行胃癌根治術(shù)，且術(shù)前均未接受放化療治療。共納入50例胃癌患者作為胃癌組，其中男29例，女21例；年齡41～80歲，平均（60.28±9.42）歲；分化程度：高分化11例，中分化24例，低分化15例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期22例，Ⅲ期14例，Ⅳ期6例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。另選取同期健康體檢者50例為健康對(duì)照組，其中男25例，女25例；年齡35～80歲，平均（58.46±10.29）歲。兩組研究對(duì)象的性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 血漿標(biāo)本采集胃癌患者分別于術(shù)前、術(shù)后1周及術(shù)后1個(gè)月采集清晨空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血5 ml，健康體檢者于體檢時(shí)采集外周靜脈血5 ml，3000 r/min離心10 min后分裝血漿與血細(xì)胞，-80℃下保存?zhèn)錂z。

1.2.2 血漿總RNA提取每份血標(biāo)本取400 μl血漿，提取RNA前再次進(jìn)行離心（12 000 r/min，4℃10 min），取血漿檢測(cè)，加入0.8倍血漿體積的TRIzol試劑，充分搖勻，置于冰上15 min，12 000 r/min離心，取上清液。采用核酸蛋白儀對(duì)RNA濃度及純度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 血漿miRNA-101、miRNA-21檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法檢測(cè) miRNA-101和miRNA-21，按TaqManmiRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司）說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄條件下轉(zhuǎn)錄目的miRNA，95℃ 30 s，95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃20 s，共40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參基因，每個(gè)標(biāo)本均檢測(cè)3次，取所獲取的全部樣本數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前胃癌組與健康對(duì)照組血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)量的比較

術(shù)前胃癌組患者血漿miRNA-101相對(duì)表達(dá)量明顯低于健康對(duì)照組，miRNA-21相對(duì)表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 術(shù)前胃癌組與健康對(duì)照組血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平的比較（± s）

表1 術(shù)前胃癌組與健康對(duì)照組血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平的比較（± s）

組別健康對(duì)照組（n=50）胃癌組（n=50）t值P值miRNA-101 7.95±2.04 1.82±0.56 20.490 0.000 miRNA-21 0.97±0.04 8.26±1.83 28.162 0.000

2.2 胃癌患者手術(shù)前后血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)量的比較

與術(shù)前比較，術(shù)后1周及術(shù)后1個(gè)月胃癌患者血漿miRNA-101相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，血漿miRNA-21相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表 2）

表2 50例胃癌患者手術(shù)前后血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平的比較（± s）

表2 50例胃癌患者手術(shù)前后血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平的比較（± s）

注：a與術(shù)前比較，P<0.05；b與術(shù)后1周比較，P<0.05

miRNA-101 1.82±0.56 5.78±1.27a 7.23±1.86a b 218.396<0.01 miRNA-21 8.26±1.83 3.23±0.85a 1.42±0.37a b 447.702<0.01時(shí)間術(shù)前（n=50）術(shù)后1周（n=50）術(shù)后1個(gè)月（n=50）F值P值

2.3 不同臨床特征的胃癌患者術(shù)前血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)量的比較

不同分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者術(shù)前血漿miRNA-101相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=66.285，t=6.104、9.579；P﹤0.05）；不同分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者術(shù)前血漿miRNA-21相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.287，t=14.204、6.534；P﹤0.05）；而不同性別、年齡胃癌患者術(shù)前血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征胃癌患者術(shù)前血漿miRNA-101、miRNA-21的相對(duì)表達(dá)水平（ n=50）

3 討論

miRNA是一類真核生物內(nèi)源性非編碼單鏈的小RNA分子，長(zhǎng)19～23個(gè)核苷酸，進(jìn)化上呈高度保守，能夠調(diào)節(jié)信使RNA的翻譯，并在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因的表現(xiàn)[6]。近年來(lái)，miRNA已成為腫瘤診斷及治療的研究熱點(diǎn)。miRNA-101被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)，其低表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)，且低表達(dá)miRNA-101的腫瘤患者生存率較低[7]。miRNA-21是最早在人類基因組中檢測(cè)到的miRNA之一，其在多種惡性腫瘤組織中呈過(guò)表達(dá)，是實(shí)體瘤中最常見(jiàn)的呈高表達(dá)的miRNA之一，可能作為一種癌基因參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。

外周血腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)有創(chuàng)傷小、易于檢測(cè)、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，是腫瘤診斷的理想手段。已有研究證實(shí)，miRNA-101在胃癌組織中呈低表達(dá)，miRNA-21在胃癌組織中呈高表達(dá)，且與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[10-11]。有研究顯示，血漿miRNA-21診斷大腸癌的靈敏度為84.5%，特異度為74.4%，故血漿miRNA-21可能成為腫瘤診斷的新手段[12]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前胃癌組患者血漿miRNA-101相對(duì)表達(dá)量明顯低于健康對(duì)照組，miRNA-21相對(duì)表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組，這與miRNA-101在子宮內(nèi)膜癌中的變化類似[13]，提示miRNA-101、miRNA-21可能參與了胃癌的發(fā)生。另有研究表明，大腸癌組織miRNA-21表達(dá)量較癌旁組織明顯增多，亦提示miRNA-21參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。本研究未對(duì)此進(jìn)行對(duì)比分析，有待進(jìn)一步補(bǔ)充以增強(qiáng)結(jié)果說(shuō)服力。本研究動(dòng)態(tài)檢測(cè)胃癌患者血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與術(shù)前比較，術(shù)后1周及術(shù)后1個(gè)月胃癌患者血漿miRNA-101相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，血漿miRNA-21相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。即手術(shù)除去腫瘤后，血漿miRNA-101表達(dá)水平迅速升高，miRNA-21表達(dá)水平迅速降低，說(shuō)明miRNA-101、miRNA-21與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，其表達(dá)異?？纱偈鼓[瘤發(fā)生，且通過(guò)檢測(cè)二者表達(dá)變化有助于評(píng)估手術(shù)療效。不少研究認(rèn)為，miRNA-101、miRNA-21與腫瘤病理分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[15-16]。本研究顯示，不同分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者術(shù)前血漿miRNA-101、miRNA-21相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與上述研究相符。表明血漿miRNA-101、miRNA-21的檢測(cè)對(duì)胃癌分期及轉(zhuǎn)移判斷有重要意義。

綜上所述，胃癌患者血漿miRNA-101呈低表達(dá)，miRNA-21呈高表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)血漿miRNA-101、miRNA-21的表達(dá)變化對(duì)判斷腫瘤分化程度、臨床分期、手術(shù)療效有著一定價(jià)值，有望成為腫瘤診斷及隨訪的新型手段。