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    PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系△

    2019-04-15 02:52:50張小三張一鳴趙燕戚春暉楊樹軍
    癌癥進(jìn)展 2019年4期
    關(guān)鍵詞:淋巴管陽性細(xì)胞食管癌

    張小三,張一鳴,趙燕,戚春暉,楊樹軍#

    1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科,鄭州 450008

    2鄭州第七人民醫(yī)院兒科,鄭州 450006 00

    食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,預(yù)后較差,轉(zhuǎn)移較早,早期癥狀不明顯,大部分患者就診時已出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1],因此,探究早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療的方法成為食管癌相關(guān)科研工作中需要不斷探索的課題。研究表明,磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,也稱AKT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠通過影響下游多種分子的活化狀態(tài)而對腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)[2]。也有研究報道稱PI3K/AKT信號通路與腫瘤微淋巴管的形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。但是,關(guān)于PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白在食管癌組織中的表達(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的相關(guān)研究目前尚未見報道。微淋巴管密度(lymphatic microvessel density,LMVD)指的是單位視野中微淋巴管的數(shù)量。有研究顯示,在胃癌組織中,LMVD是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素,即LMVD的增加有利于胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,分析其原因可能是因?yàn)槲⒘馨凸軘?shù)量的增加使腫瘤和淋巴管內(nèi)皮接觸的面積增大,從而促使腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入淋巴管發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[4]。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測PI3K和AKT蛋白在食管癌組織中的表達(dá)情況,并分析PI3K和AKT蛋白表達(dá)與食管癌患者臨床特征以及LMVD的關(guān)系,現(xiàn)報道如下。

    1 對象與方法

    1.1 研究對象

    選取2017年4月至2018年2月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院收治的術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為食管癌的120例患者的組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)為食管癌;②術(shù)前未行靶向治療、放療、化療或者免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并嚴(yán)重的心、肺疾??;②術(shù)前行新輔助放化療、靶向治療。120例食管癌患者中,男70例,女50例;年齡40~79歲,平均年齡為(48.87±9.45)歲;按照國際抗癌聯(lián)盟TNM分期第8版[5]:Ⅰ+Ⅱ期64例,Ⅲ+Ⅳ期56例;組織分化程度:高分化40例,中分化50例,低分化30例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。同時收集上述患者癌旁(距腫瘤邊緣﹥2 cm)經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)的120例食管正常黏膜組織標(biāo)本作為對照?;颊呒凹覍倬鶎Ρ狙芯恐橥獠⒑炇鹬橥鈺狙芯拷?jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過。

    1.2 主要抗體和試劑盒

    兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人AKT多克隆抗體、D2-40單克隆抗體均購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒、免疫組織化學(xué)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

    對所有組織標(biāo)本采用10%中性福爾馬林溶液固定,常規(guī)取材,石蠟包埋。后將蠟塊進(jìn)行切片,置入40%的乙醇中,然后置于40℃水浴鍋中水浴4 min,進(jìn)行展開,然后置于60℃烘箱內(nèi)烘干。采用二甲苯脫蠟20 min,然后采用梯度乙醇進(jìn)行水化,對PI3K、AKT、D2-40蛋白進(jìn)行高溫高壓組織修復(fù),然后加入3%過氧化氫溶液,室溫下孵育10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)進(jìn)行沖洗,加入5%羊血孵育30 min,除去封閉液,加入一抗,置于4℃冰箱過夜,PBS沖洗,DAB顯色,然后使用PBS沖洗終止顯色,使用自來水沖洗,鹽酸乙醇分化,乙醇脫水干燥。對PI3K和AKT蛋白表達(dá)情況進(jìn)行判定。

    1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

    1.4.1 PI 3 K和AKT陽性判定標(biāo)準(zhǔn)[6]PI3K和AKT蛋白均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),陽性染色結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比兩項(xiàng)評分總分判定PI3K和AKT蛋白是否陽性表達(dá)。依據(jù)染色強(qiáng)度評分:無著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,黃褐色為3分。依據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評分:陽性細(xì)胞﹤10%記為0分;陽性細(xì)胞所占百分比為10%~20%記為1分;陽性細(xì)胞所占百分比為21%~50%記為2分;陽性細(xì)胞所占百分比﹥50%記為3分。最終得分為染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比評分之和,﹥2分為陽性表達(dá),≤2分為陰性表達(dá)。

    1.4.2 LMVD計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)[7]D2-40表達(dá)定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,呈棕黃色或棕褐色顆粒,先在低倍鏡下選取微淋巴管染色豐富的區(qū)域,然后在高倍鏡下每個區(qū)域中選取5個視野(每個視野0.16 mm2)分別計(jì)算微淋巴管數(shù)目,取平均值作為LMVD。含有平滑肌或﹥8個內(nèi)皮細(xì)胞的管腔及未染色的管腔均不記數(shù)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同組織中PI 3 K和AKT蛋白表達(dá)情況的比較

    食管癌組織中PI3K和AKT蛋白的陽性表達(dá)率分別為85.0%(102/120)和86.7%(104/120),均明顯高于癌旁食管正常黏膜組織中的4.2%(5/120)和5.8%(7/120),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=158.679、157.704,P﹤0.01)。(表1、圖1)

    表1 食管癌組織和癌旁食管正常黏膜組織中PI 3 K和AKT蛋白的表達(dá)情況[ n(%)]

    圖1 PI 3 K和AKT在食管癌組織和癌旁食管正常黏膜組織中的表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

    2.2 食管癌組織中PI 3 K和AKT蛋白表達(dá)情況與食管癌患者臨床特征的關(guān)系

    不同性別、組織分化程度食管癌患者食管癌組織中PI3K、AKT蛋白的陽性表達(dá)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期食管癌患者的食管癌組織中PI3K蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.232、10.756,P﹤0.01)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的食管癌患者食管癌組織中AKT蛋白的陽性表達(dá)率均高于無淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.809、5.781,P﹤0.05)。(表2)

    2.3 食管癌組織中LMVD與PI 3 K、AKT蛋白表達(dá)的關(guān)系

    PI3K蛋白陽性表達(dá)食管癌組織中LMVD為(13.92±3.02),明顯高于PI3K蛋白陰性表達(dá)食管癌組織的(6.54±1.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.228,P﹤0.01);AKT蛋白陽性表達(dá)食管癌組織中LMVD的數(shù)量為(13.84±3.08),明顯高于AKT蛋白陰性表達(dá)食管癌組織的(6.14±0.89),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.904,P﹤0.01)。

    表2 不同臨床特征食管癌患者食管癌組織中PI 3 K、AKT蛋白的陽性表達(dá)情況( n=120)

    3 討論

    作為世界上高發(fā)的惡性腫瘤之一,食管癌在中國腫瘤發(fā)病率中排名第5位,病死率中排名第4位,隨著人們生活節(jié)奏的不斷加快,飲食不規(guī)律的現(xiàn)象逐漸增多,因此,食管癌的發(fā)病率也呈逐年增加態(tài)勢。并且,因早期食管癌的臨床癥狀不明顯,患者往往于就診時已出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,大大增加了患者的病死率[8]。

    PI3K是一種胞內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶,參與多種生長因子的活化;AKT作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,能夠直接對多種轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行磷酸化,從而參與生命活動的調(diào)節(jié)進(jìn)程[9]。研究表明,PI3K/AKT信號通路不僅參與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié),還與腫瘤微淋巴管的生成和侵襲密切相關(guān)[10],目前已經(jīng)成為了腫瘤靶向治療研究的熱點(diǎn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),PI3K在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織,且PI3K的表達(dá)與TNM分期、腫瘤大小密切相關(guān),而與患者的年齡無關(guān)[9]。Yamamoto等[11]研究發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞中,PI3K/AKT信號通路激活抑制了細(xì)胞周期蛋白的降解,促進(jìn)了G0期細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期(S期),從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的異常增殖。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測食管癌和癌旁正常黏膜組織中PI3K和AKT蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,食管癌組織中PI3K和AKT蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁食管正常黏膜組織(P﹤0.01),提示PI3K/AKT信號通路在食管癌的發(fā)生過程中起著重要的作用。

    有研究表明,PI3K/AKT信號通路能夠直接或間接地促進(jìn)腫瘤新生血管的生成,在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)程中發(fā)揮著極其重要的作用[12]。也有研究認(rèn)為PI3K/AKT信號通路參與了淋巴管的生成,從而參與了腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移進(jìn)程[13]。本研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白陽性表達(dá)食管癌組織中的LMVD分別高于PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白陰性表達(dá)食管癌組織,推測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白在食管癌淋巴管的生成方面可能起著關(guān)鍵作用;同時研究還發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者食管癌組織中的PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白陽性表達(dá)率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者(P﹤0.05),TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期食管癌組織中的PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白陽性表達(dá)率均高于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者(P﹤0.05),推測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白在促進(jìn)食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面也起著至關(guān)重要的作用。

    綜上所述,PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白在食管癌發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中均起著至關(guān)重要的作用,阻斷該信號通路的某一環(huán)節(jié),可能成為食管癌的新的治療靶點(diǎn)。

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