熒光光譜法測(cè)定淀粉中的直鏈淀粉

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(忻州師范學(xué)院化學(xué)系,山西忻州 034000)

天然淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩大主要成份組成,直鏈淀粉與支鏈淀粉在不同來(lái)源的淀粉中的含量不同。大多數(shù)植物的淀粉中直鏈淀粉含量為10%～12%,但有一些植物的淀粉中直鏈淀粉含量較高。如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉中直鏈淀粉的含量分別為27%和20%[1]。直鏈淀粉用途廣泛,涉及食品、醫(yī)療保健、材料、紡織、造紙、包裝、環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域,可用作食品添加劑、增厚劑、固定劑和包衣劑,還可用于制作對(duì)氧和油脂具有良好隔絕性的產(chǎn)品保護(hù)層等[2]。由于直鏈淀粉具有優(yōu)越的性能和廣泛的應(yīng)用前景,且其含量在評(píng)價(jià)糧食和食品品質(zhì)及農(nóng)業(yè)選種、育種中具有重要意義,因此選擇一種準(zhǔn)確、有效、簡(jiǎn)便的測(cè)定直鏈淀粉含量的測(cè)定方法具有重要的實(shí)際意義[3]。

測(cè)定直鏈淀粉含量的標(biāo)準(zhǔn)方法是碘比色法[4],它包括國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn),這些標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定,前處理復(fù)雜,技術(shù)性強(qiáng),步驟繁瑣,應(yīng)用受到很大限制;目前常用的直鏈淀粉含量的測(cè)試方法是碘親和力滴定法[5]和雙波長(zhǎng)法[6]。碘親和力滴定法有電位滴定法和電流滴定法,借助于電位和電流的變化,使得該法快速、簡(jiǎn)便,能進(jìn)行大批量樣品的檢測(cè)。但由于支鏈淀粉也會(huì)與碘形成絡(luò)合物,因此,測(cè)定有一定的誤差,雙波長(zhǎng)法克服了上述缺點(diǎn),提高了靈敏度和選擇性。也曾有采用伴刀豆球蛋白法[7]和排阻色譜分析法[8]測(cè)定直鏈淀粉含量的報(bào)道,這兩種方法雖然測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,但伴刀豆球蛋白法要求在指定的pH、溫度和離子強(qiáng)度下測(cè)定,原理復(fù)雜,使用酶試劑;排阻色譜分析法淋洗時(shí)間長(zhǎng),色譜柱的要求高,而且需要將直鏈淀粉從被測(cè)樣品中分離。最新發(fā)展的直鏈淀粉含量測(cè)定的方法有近紅外光譜分析法[9]、自動(dòng)分析檢測(cè)法[10],近紅外光譜分析法方便、樣品用量小,不消耗化學(xué)試劑,不污染環(huán)境。但它的準(zhǔn)確性與定標(biāo)模型建立的質(zhì)量和合理使用模型有很大關(guān)系,收集模型樣品人力、物力耗費(fèi)大,而且不能用于直鏈淀粉含量的精確測(cè)定和食品材料的評(píng)價(jià)。自動(dòng)分析檢測(cè)法原理與碘比色法一樣,用儀器代替了人工,提高了工作效率,但需經(jīng)常更換塑膠藥管等零配件。

Charoenkuln等[11]報(bào)道了采用熒光標(biāo)記和高效排阻色譜法同時(shí)測(cè)定木薯直鏈淀粉含量和支鏈淀粉鏈長(zhǎng)的方法,這種方法雖然測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,但測(cè)定過(guò)程既需分離直鏈淀粉,又需進(jìn)行熒光標(biāo)記反應(yīng),不僅測(cè)定步驟繁瑣,而且測(cè)定條件苛刻。因此,對(duì)直鏈淀粉含量的測(cè)試迫切需要一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法。本實(shí)驗(yàn)探究了利用直鏈淀粉自身產(chǎn)生的熒光信號(hào),不加顯色劑,不加熒光標(biāo)記物,不需要分離,快速、準(zhǔn)確的測(cè)定淀粉中直鏈淀粉含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品 梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;玉米淀粉、土豆淀粉 食品級(jí),忻州華美超市。

F-4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;pHS-3TC精密數(shù)顯酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司;AB204-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 稱(chēng)取10 g過(guò)100目篩的玉米淀粉和土豆淀粉,用石油醚脫脂3次,在恒溫干燥箱中于120 ℃恒溫干燥3 h,待用。

1.2.2 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的支鏈淀粉和直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品,用二次蒸餾水分別配制1.0 mg/mL、1.0 μg/mL的支鏈淀粉、直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品水溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液的配制:用1.0 μg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品水溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL分別于7個(gè)10 mL比色管中,用二次水稀釋到刻度,得0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品水溶液。

玉米淀粉、土豆淀粉溶液配制:稱(chēng)取處理好的玉米淀粉樣品、土豆淀粉樣品,配制1.0 mg/mL和1.0 μg/mL的玉米淀粉和土豆淀粉溶液。

1.2.3 激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的測(cè)定 在2支10 mL比色管中,加入4.0 mL濃度為1.0 μg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用二次蒸餾水定容至刻度,搖勻。在狹縫寬度為5 nm，在300～480 nm范圍內(nèi)熒光掃描,確定其最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。

1.2.4 放置時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 分別移取濃度為0.4 μg/mL直鏈淀粉水溶液于10 mL比色管中,在狹縫寬度為5 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm條件下,分別測(cè)定溶液放置時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 取10份0.4 μg/mL直鏈淀粉水溶液于10 mL比色管中,在狹縫寬度為5 nm,激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm條件下,分別測(cè)定溫度為20、24、28、32、36、40、44、48、52、56 ℃的熒光強(qiáng)度。

1.2.6 干擾試驗(yàn) 分別準(zhǔn)確移取0.4 mL濃度為1.0 mg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品水溶液于6個(gè)1000 mL容量瓶中,然后分別加入4.0、8.0、16.0、24.0、32.0、40.0 mL濃度為1.0 mg/mL的支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品水溶液,得到含有0.4 μg/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品和4.0、8.0、16.0、24.0、32.0、40.0 μg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液中(即混合溶液中直鏈淀粉與支鏈淀粉濃度比為1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100)。在狹縫寬度為5 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm條件下,分別測(cè)定六個(gè)混合溶液的熒光強(qiáng)度。

1.2.7 方法檢出限的測(cè)定與計(jì)算 在狹縫寬度為5 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm條件下,分別測(cè)定10份濃度為0.10 μg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的熒光強(qiáng)度,參考文獻(xiàn)[12]方法,按如下公式計(jì)算方法檢出限:

式中:CL-方法檢出限(μg/mL);s-標(biāo)準(zhǔn)偏差;k-標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率。

1.2.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 采用文獻(xiàn)[13]方法測(cè)定平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 熒光光譜法與國(guó)標(biāo)法的比較 于4支25 mL比色管中分別加入0.60 μg/mL玉米淀粉、土豆淀粉溶液,在狹縫5 nm條件下,分別測(cè)定2支玉米淀粉、土豆淀粉溶液的熒光強(qiáng)度,平行測(cè)定6次;另參照國(guó)標(biāo)GB 7648-1987分析方法[15],分別測(cè)定另2支玉米淀粉與土豆淀粉中直鏈淀粉的含量,平行測(cè)定6次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)和圖表均采用Excel(2010版)和Orgin 8.5軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

由實(shí)驗(yàn)得出直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of amylose

由圖1可知,直鏈淀粉在0.10～0.70 μg/mL范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好線(xiàn)性關(guān)系,其線(xiàn)性回歸方程為:y=26.768x+49.974,r=0.9996。

2.2 激發(fā)與發(fā)射光譜

按照1.2.3測(cè)定方法,測(cè)定直鏈淀粉的熒光光譜,結(jié)果如圖2、圖3所示。由圖2～圖3可知,直鏈淀粉激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為370和422 nm。這與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的淀粉-水懸浮液的熒光位于300～450 nm相吻合。直鏈淀粉是由α-D-葡萄糖通過(guò)α-D-1,4糖苷鍵連接而成的鏈狀分子,其分子結(jié)構(gòu)中含有C-O-C的環(huán)醚鍵,吸光后環(huán)醚鍵C-O-C中的氧未共享電子發(fā)生n→π*躍遷,從而產(chǎn)生了熒光[14]。

圖2 直鏈淀粉激發(fā)光譜Fig.2 Excitation spectrum of amylose

圖3 直鏈淀粉發(fā)射光譜Fig.3 Emission spectrum of amylose

2.3 溶液放置時(shí)間的確定

按照1.2.4測(cè)定方法,測(cè)定放置時(shí)間對(duì)溶液熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng),溶液的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化,因此,本試驗(yàn)采用即測(cè)即配溶液的方法。

圖4 放置時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of placement time on luorescence intensity

2.4 測(cè)定溫度的確定

按照1.2.5測(cè)定方法,測(cè)定溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,隨著溫度的增大,在32 ℃之前淀粉的熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì),32 ℃到44 ℃呈下降趨勢(shì),從48 ℃到56 ℃又在緩慢增加,但仍然小于32 ℃時(shí)的熒光,即32 ℃溫度時(shí)熒光最大。因此,實(shí)驗(yàn)測(cè)定溫度為32 ℃。其原因可能是32 ℃之前,隨著溫度的增加,直鏈淀粉中的C-O-C環(huán)醚鍵中的氧未共享電子更易發(fā)生n→π*躍遷,使熒光強(qiáng)度最大,隨著溫度繼續(xù)升高,光化分解的發(fā)生熒光量子產(chǎn)率減小,熒光淬滅。熒光強(qiáng)度減小。

圖5 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of temperature on florescence intensity

2.5 干擾試驗(yàn)

因?yàn)榈矸勖撝蟮闹饕煞质侵辨湹矸酆椭ф湹矸?因此,本試驗(yàn)分別測(cè)定了支鏈淀粉對(duì)直鏈淀粉含量測(cè)定的干擾情況。

直鏈淀粉與支鏈淀粉不同的濃度比對(duì)熒光強(qiáng)度的影響如圖6所示。由圖6可知,在固定濃度的直鏈淀粉混合溶液中,隨著支鏈淀粉濃度比例的增大,熒光強(qiáng)度數(shù)值基本不變,說(shuō)明支鏈淀粉的存在基本不影響直鏈淀粉含量的測(cè)定,這與文獻(xiàn)[14]的結(jié)果也是吻合的。

圖6 支鏈淀粉和直鏈淀粉的濃度比對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of concentration ratio of amylopectin and amylose on fluorescence intensity

2.6 方法檢出限的計(jì)算

按照1.2.7測(cè)定方法,測(cè)定10份濃度為0.10 μg/mL的直鏈淀粉溶液的熒光強(qiáng)度,計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)偏差為s=0.233,按照1.2.7檢出限計(jì)算公式計(jì)算得方法檢出限CL為0.026 μg/mL。

2.7 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定

按照1.2.8試驗(yàn)方法,分別對(duì)0.20,0.40,0.60 μg/mL 3個(gè)水平做回收率試驗(yàn)。平行測(cè)定6次。并根據(jù)2.1線(xiàn)性回歸方程計(jì)算直鏈淀粉含量和加標(biāo)回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery experiment

由表1可知,樣品的回收率分別為94.5%～121.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.42%～3.24%,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度和精密度均好。

2.8 熒光光譜法與國(guó)標(biāo)法的比較分析

根據(jù)2.1線(xiàn)性回歸方程計(jì)算直鏈淀粉在原淀粉中所占的百分含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差;參照國(guó)標(biāo)GB 7648-1987分析方法[15]測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中直鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果(n=6,%)Table 2 Determination results of amylose content in the sample(n=6,%)

由表1數(shù)據(jù)得出玉米淀粉與土豆淀粉的平均回收率均優(yōu)于國(guó)標(biāo)分析法,說(shuō)明對(duì)于玉米淀粉與土豆淀粉,熒光光譜法的精密度比單波長(zhǎng)分光光度法的精密度高。不管是玉米淀粉還是土豆淀粉,熒光光譜法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均比國(guó)標(biāo)GB 7648-1987分析方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小,說(shuō)明熒光光譜法的準(zhǔn)確度比國(guó)標(biāo)GB 7648-1987分析方法準(zhǔn)確度高,其原因可能與國(guó)標(biāo)GB 7648-1987分析方法的原理有關(guān),國(guó)標(biāo)法的原理是淀粉與碘形成碘-淀粉復(fù)合物的過(guò)程有特殊的顏色反應(yīng),支鏈淀粉與碘生成棕紅色復(fù)合物,直鏈淀粉與碘生成深藍(lán)色復(fù)合物,在淀粉總量不變的條件下,將這兩種淀粉分散液按不同比例混合,在一定的波長(zhǎng)和酸度條件下與碘作用,生成由紫紅到深藍(lán)的一系列顏色,根據(jù)吸光度與直鏈淀粉濃度呈線(xiàn)性關(guān)系,可用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。在這個(gè)過(guò)程中,兩種顏色的相互影響,可能會(huì)造成其中每種顏色吸光度測(cè)定的不準(zhǔn)確,從而導(dǎo)致測(cè)算的精密度和準(zhǔn)確度較差。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以超市購(gòu)買(mǎi)的玉米淀粉、土豆淀粉為樣品,應(yīng)用熒光光譜分析技術(shù)建立了熒光光譜法測(cè)定淀粉中直鏈淀粉的方法。用該方法測(cè)定淀粉中的直鏈淀粉,不需要任何化學(xué)試劑,直接測(cè)定淀粉溶液的熒光強(qiáng)度即可,方法簡(jiǎn)單、快速,為淀粉及淀粉食品或淀粉材料中直鏈淀粉的測(cè)定提供了一種準(zhǔn)確、靈敏的方法。