全麥粉對體外腸道菌群的影響

, , ,

(北京工商大學(xué),食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物,總產(chǎn)量最高,總貿(mào)易量最大,栽培面積和分布面積最廣[1]。全麥粉包含完整的胚芽、胚乳和麩皮,麩皮和胚芽中含有豐富的生物活性化合物,包括B族維生素、礦物質(zhì)、必需氨基酸、維生素E和植物化學(xué)素[2]。而人們經(jīng)常食用的面粉,即精致小麥則去掉了麩皮和胚芽,僅保留胚乳部分[3]。隨著人們生活水平的改善，精制面粉占據(jù)大部分市場,與此同時(shí),各種慢性疾病如肥胖、糖尿病、癌癥等發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)也越來越高[4]。全麥粉較精制小麥粉而言,含有較多的營養(yǎng)成分和植物化學(xué)素,一方面這些成分保持原生狀態(tài)并存在著協(xié)同增效作用,另一方面,某些物質(zhì)不被人體內(nèi)源性消化酶所水解,直接進(jìn)入大腸被腸道微生物發(fā)酵利用產(chǎn)生代謝產(chǎn)物,維持腸道健康,故增加全谷物的攝入更有利于人體健康。

腸道菌群是一個(gè)龐大復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),一個(gè)健康成人腸道處居住著500～1000種細(xì)菌,總數(shù)達(dá)1013～1014,是人體體細(xì)胞的10倍之多,它們編碼的基因是人體自身基因的100倍,大量研究表明腸道菌群組成的結(jié)構(gòu)和比例與人體健康狀況存在著密切的聯(lián)系[5]。全麥粉相比于精制小麥粉,外層的麩皮富含纖維、抗性淀粉和低聚糖,內(nèi)層胚芽含有維生素、礦物質(zhì)、多酚等有益物質(zhì),這些物質(zhì)的存在可能會(huì)降低血糖指數(shù)或血糖負(fù)荷,改善糖代謝,并減少超重和肥胖的發(fā)生[6]。研究表明全谷物中的膳食纖維易吸水膨脹,可增加人體飽腹感,有利于減少食物的攝入,具有減少腸道間有毒物質(zhì)殘留,預(yù)防痔瘡、便秘、調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境等功效[7]。

本文選用山東小麥,用分層碾米機(jī)磨去外層麩皮得到小麥籽粒,全麥粉由麩皮與籽粒經(jīng)研磨得到,精制小麥粉由小麥籽粒研磨得到,依次進(jìn)行體外模擬消化和發(fā)酵實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性(NC)及陽性(PC)對照,陰性對照不添加小麥粉,陽性對照選擇低聚果糖。通過比對全麥粉與精制小麥粉成分區(qū)別、以及不同組腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與代謝產(chǎn)物的區(qū)別,研究了全麥粉和精制小麥粉對腸道菌群調(diào)節(jié)的影響,旨在通過腸道菌群的視角呼吁大眾多食用全谷物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥 山東沂蒙山新小麥,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供;α-淀粉酶(1 kU/g)、胃蛋白酶(8 kU/g)、胰液素 美國sigma公司;豬膽鹽、低聚果糖、透析袋(1000 Da) 上海源葉生物有限公司;胰蛋白胨酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;無水氯化鈣、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 分析純,西隴化工股份有限公司;七水硫酸鎂、樹脂天青、維生素K1、氯化血紅素 分析純,麥克林公司;L-半胱氨酸、吐溫80 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;β-葡聚糖試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司;DNA提取試劑盒 美國Omega公司;DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

AL203電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;YXQ-LS-50A高壓滅菌鍋 上海云泰儀器儀表有限公司;TM05C-C分層碾米機(jī) 佐竹機(jī)械(蘇州)有限公司;FDV氣引粉碎機(jī) 日本佑崎有限公司;DG250小型厭氧工作站 英國Don Whitley Scientific公司;920 Titrando恒定pH電位滴定儀 美國奧豪斯(上海)有限公司;Free-zoneRR實(shí)驗(yàn)室凍干機(jī) 美國LABCONCO公司;C-MAG HS 7磁力攪拌器 德國IKA公司;AOC-20i氣相色譜(配有氫火焰離子檢測器) 日本島津公司;NanoDrop2000紫外分光光度計(jì) 美國賽默飛公司;LX-07A研磨機(jī) 紅光工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精制小麥粉的制備及前處理 參照Gong等[8]方法,全谷小麥用分層碾米機(jī)磨去占總質(zhì)量20%的外層麩皮后,剩下的籽粒即為精制小麥谷物。全谷小麥和精制小麥用氣引式粉碎機(jī)粉碎,并過80目篩,分別得到全麥粉(whole wheat,WW)和精制小麥粉(refined wheat,RW)。

1.2.2 谷物粉基本成分及部分活性成分的測定 水分含量測定參照:GB5009.3-2010;灰分含量測定參照:GB5009.4-2010;脂肪含量測定參照:GB/T 5009.6-2003;蛋白質(zhì)含量測定參照:GB5009.5-2010;膳食纖維含量的測定參照:GB/T 5009.88-2014;β-葡聚糖含量的測定方法參照試劑盒中AACC Method 32-23.01方法進(jìn)行測定;多酚含量測定參照龔凌霄[9]的方法。

1.2.3 培養(yǎng)基的配制 胰蛋白胨2 g/L、酵母浸粉2 g/L、氯化鈉0.1 g/L、磷酸氫二鉀0.04 g/L、碳酸鈉2 g/L、七水硫酸鎂0.01 g/L、無水氯化鈣0.01 g/L、吐溫80 2 mL/L、氯化血紅素50 mg/L、維生素K110 μL/L、L-半胱氨酸0.5 g/L、豬膽鹽0.5 g/L、樹脂天青1 mg/L。配成溶液后,用1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH=6.8,經(jīng)高壓滅菌后轉(zhuǎn)移到厭氧工作站除氧24 h。

1.2.4 發(fā)酵菌液的采集與制備 選取自愿者3人,要求身體健康,沒有胃腸病史,近半年來沒有接受過抗生素的治療。于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天采集3位志愿者的糞便各30 g左右,置于厭氧箱中,采集過程10 min內(nèi)完成。用10倍量(w/v)的磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH=6.8)稀釋采集的糞便,混勻后靜置用四層紗布濾去殘?jiān)礊榘l(fā)酵菌液。

1.2.5 體外模擬胃腸道消化和發(fā)酵過程 參照曹文燕等[10]方法,取WW與RW各12 g,分別加入100 mL去離子水在121 ℃條件下滅菌15 min冷卻后再加入100 mL無菌蒸餾水,得全麥粉與精制小麥粉懸濁液;于懸濁液中加入7 mL(20 U/mL)α-淀粉酶溶液,在37 ℃恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)30 min以模擬口腔消化;用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH=2,加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸(含0.54 g胃蛋白酶),37 ℃恒溫水浴振蕩器培養(yǎng)2 h,模擬胃消化;用6 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=6.8,并加入25 mL 0.5 mol/L碳酸氫鈉(含0.11 g胰液素和0.7 g豬膽鹽),放入1000 Da的再生纖維素透析袋中,在0.1 mol/L氯化鈉溶液,37 ℃過夜透析,第2 d更換一次透析液,再透析2 h,模擬小腸消化;將透析袋中的消化乳糜低溫真空冷凍干燥得消化糜粉。取消化糜粉0.5 g,與45 mL培養(yǎng)基(按照1.2.3制備)、5 mL發(fā)酵菌液(按照1.2.4制備)充分混勻后在37 ℃厭氧條件下發(fā)酵48 h,模擬大腸消化;分別于24和48 h取部分發(fā)酵液用于菌群多樣性和短鏈脂肪酸分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性及陽性對照,其中,陰性對照即以0.5 g純凈水代替消化糜(NC),陽性對照即0.5 g低聚果糖代替消化糜(PC)。

1.2.6 新一代16S rRNA測序技術(shù)對菌群多樣性分析 參照試劑盒Stool DNA kits提取發(fā)酵液中總的DNA,用紫外分光光度計(jì)于260 nm測定OD值,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA進(jìn)行檢測。擴(kuò)增細(xì)菌的16S區(qū)域V4區(qū),擴(kuò)增引物515F(5′ GTGCCAGC MGCCGCGGTAA 3′)和806R(5′ GGACTACHVGGG TWTCTAAT 3′),在引物的5′端加上合適的Hiseq2500 PE250測序的index序列和接頭序列,完成特異性引物的設(shè)計(jì)。以稀釋后的基因組DNA為模板,使用KAPA HiFiHotstart ReadyMix PCR kit高保真酶進(jìn)行PCR[11],確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。切膠回收后,用紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行文庫質(zhì)檢。質(zhì)檢合格后,使用Illumina Hiseq PE250進(jìn)行上機(jī)測序。測序結(jié)束后,按照相似度97%進(jìn)行聚類,得到OTU(Operational Taxonomic Units),每個(gè)OTU被認(rèn)為可以代表一個(gè)物種。

1.2.7 氣相色譜(GC)測定發(fā)酵液中短鏈脂肪酸(SCFA)含量

1.2.7.1 樣品前處理 取發(fā)酵24、48 h的2 mL發(fā)酵液,加0.2 mL 50% H2SO4酸化10 min,再加2 mL乙醚在冰上間歇震蕩提取30 min,后于4800 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)樣[12]。

1.2.7.2 色譜條件色譜柱 SH-Rtx-5柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);以氮?dú)庾鳛檩d氣,總流速為140 mL/min;進(jìn)樣量1 μL,進(jìn)樣口溫度280 ℃,FID檢測器溫度300 ℃,不分流;采用程序升溫:80 ℃;3 ℃/min,150 ℃;20 ℃/min,250 ℃,2 min[13]。

1.2.8 相關(guān)性分析 利用Pearson對發(fā)酵液中SCFA與腸道菌群的變化量相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分分析

從表1可知,全麥粉(WW)中膳食纖維含量顯著高于精制小麥粉RW(p<0.05),達(dá)12.45%,與趙吉?jiǎng)P等[14]研究一致,碾磨脫去小麥籽?？傎|(zhì)量20%的外層麩皮(主要含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素),RW中總膳食纖維降低了33.1%。WW中總酚含量顯著高于RW(p<0.05),達(dá)2765.50 μg GAE/g,與向莉[15]對黑小麥多酚含量的測定相近。除此之外,WW中蛋白質(zhì)、脂肪含量也顯著高于RW(p<0.05)。研究表明,WW較RW在成分組成上,膳食纖維和多酚等可被微生物發(fā)酵利用的成分含量顯著增加(p<0.05),分別為精制小麥粉的1.49倍和1.45倍。

表1 基本成分Table 1 Component of samples

2.2 小麥粉對體外發(fā)酵腸道微生物的α-多樣性的影響

從圖1可知,隨著測序深度的延長,曲線趨于平緩,這表明本實(shí)驗(yàn)測序深度挖掘的信息量足夠本實(shí)驗(yàn)分析[16]。用Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)來評價(jià)微生物α-多樣性,從表2可知,與陽性和陰性對照組相比,WW和RW微生物多樣性下降,WW下降更多,產(chǎn)生這種結(jié)果可能是由于WW和RW中復(fù)雜的化學(xué)組成在體外進(jìn)行發(fā)酵后,打破了原有體系中微生物之間的平衡,刺激了某些微生物的生長,導(dǎo)致微生物-微生物之間產(chǎn)生競爭作用,降低了微生物多樣性。杜亞軍[17]研究了7種水溶性膳食纖維發(fā)現(xiàn)顯著促進(jìn)了雙歧桿菌或嗜酸乳桿菌的生長,而嗜酸乳桿菌或雙歧桿菌的增殖對大腸桿菌的生長產(chǎn)生了抑制作用。這表明某些微生物的生長會(huì)改變另一些微生物的生長情況,與本文的研究結(jié)果一致。而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,由于營養(yǎng)物質(zhì)有限,微生物多樣性呈現(xiàn)下降趨勢。

圖1 Shannon稀釋曲線圖Fig.1 Shannon rareation curve

表2 α-多樣性指數(shù)Table 2 Index of α-diversity

如圖2所示,發(fā)酵24 h后,各組間共有OTU 103個(gè),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長到48 h時(shí),各組間共有OTU減少到74個(gè)。與陰性和陽性對照組相比,WW和RW發(fā)酵24 h后,特有OTU較少,分別為1和2個(gè)OUT,發(fā)酵48 h后特有OUT則減少為0和1個(gè),這同樣也表明了WW和RW發(fā)酵后微生物多樣性降低。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間Veen圖Fig.2 Veen diagram of different fermentation times

2.3 小麥粉對體外發(fā)酵腸道微生物物種組成的影響

圖3A和圖3B分別是物種在門和屬的水平上進(jìn)行的物種組成分析。變形菌門(Proteobacteria)為革蘭氏陰性菌,包含大多數(shù)致病菌,如大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)等[18],與添加發(fā)酵基質(zhì)組相比,圖3A所示,陰性對照組(不添加發(fā)酵基質(zhì))中變形菌門相對豐度較高,高達(dá)13%～20%;WW組在體外發(fā)酵變形菌門相對豐度最低,比陰性對照組大約降低了5倍,這表明小麥中某一成分在體外發(fā)酵時(shí)抑制了變形菌門的生長繁殖。與陽性對照組相比,添加小麥發(fā)酵后在門的水平上發(fā)生了明顯的變化,擬桿菌門(Bacteroidetes)降低,厚壁菌門(Firmicutes)升高,可能是谷物中成分刺激了厚壁菌門生長,厚壁菌門大量增殖占用了發(fā)酵液中的營養(yǎng)和空間,從而抑制了擬桿菌門的生長。

圖3 相對豐度柱狀圖Fig.3 Relative abundance histogram注:A:在門的水平上;B:在屬的水平上。

低聚果糖被公認(rèn)為是一種益生元,低聚果糖能夠刺激益生菌雙歧桿菌(Bifidobacterium)[19]和乳酸桿菌(Lactobacillus)的生長,同時(shí)在體外能夠維持普斯菌屬(Prevotella)的生長[20]。與陰性對照組相比,添加小麥谷物發(fā)酵,降低了艾克曼菌屬(Akkermansia)、擬桿菌屬(Bacteroides)、噬膽菌屬(Bilophila)、布勞特氏菌屬(Blautia)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、埃希式菌屬(Escherichia)、梭菌屬(Dorea)毛螺菌屬(Lachnospira)、顫螺菌屬(Oscillospira)、副桿菌屬(Parabacteroides)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)和瘤胃球菌屬(Ruminoccus)的相對豐度,Jensen等[21]研究發(fā)現(xiàn)梭菌屬(Dorea)、埃希式菌屬、顫螺菌屬和瘤胃球菌屬可能會(huì)增加炎癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn);升高了氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、小類桿菌屬(Dialister)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、巨單胞菌屬(Megamonas)、和巨型球菌屬(Megasphaera)相對豐度。與RW相比,WW發(fā)酵升高了氨基酸球菌屬、雙歧桿菌屬、噬膽菌屬、巨單胞菌屬、巨型球菌屬的相對豐度,且雙歧桿菌屬相對豐度是RW發(fā)酵的1.19倍,表明WW較RW更易刺激益生菌-雙歧桿菌的增殖;降低了脫硫弧菌屬、小類桿菌屬、埃希式菌屬(Faecalibacterium)、普斯菌屬和薩特式菌屬(Sutterella)的相對豐度,且埃希氏菌屬相對豐度降低了52%。以上結(jié)果表明,體外添加小麥基質(zhì)發(fā)酵后,會(huì)調(diào)節(jié)腸道微生物物種組成的變化,與RW相比,WW更易刺激雙歧桿菌生長,抑制致病菌埃希氏菌的增殖。

2.4 短鏈脂肪酸(SCFA)含量的測定

SCFA主要是飲食中不被內(nèi)源性消化酶所消化的乳糜物質(zhì)進(jìn)入大腸后被微生物利用發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,是2～4碳組成的脂肪酸,在大腸處乙酸大約為60%,丙酸為25%,丁酸為15%,大部分的乙酸參與系統(tǒng)循環(huán)達(dá)到周邊組織,丙酸主要被肝臟利用,然而大部分的丁酸作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的能量物質(zhì)被利用[22-23]。乙酸、丙酸與丁酸在腸道中的含量最高,是腸道中主要的短鏈脂肪酸[24]。此實(shí)驗(yàn)只對這三種短鏈脂肪酸做相應(yīng)檢測。由表3可得,與發(fā)酵48 h的陰性對照組相比,WW、RW發(fā)酵48 h后乙酸、丙酸、丁酸的含量均顯著增加(p<0.05),且發(fā)酵48 h后WW中的乙酸含量與陽性對照組接近。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),發(fā)酵過程中WW和RW內(nèi)的丙酸在短鏈脂肪酸中含量最高,這可能與接種源個(gè)體差異有關(guān),De等[25]分別用10個(gè)不同的個(gè)體糞便發(fā)酵小麥麩皮,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸、丙酸和丁酸的比例和個(gè)人差異性有關(guān)。在物種組成分析(圖3B)時(shí),WW組和RW組在體外發(fā)酵后巨單胞菌屬(Megamonas)和巨行球菌屬(Megasphaera)豐度較高,達(dá)60%,Megamonas和Megasphaera是產(chǎn)丙酸鹽的細(xì)菌[26],因此丙酸含量較高。

表3 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量(mmol/L)Table 3 Short-chain fatty acid contents of fermentation broth(mmol/L)

2.5 短鏈脂肪酸(SCFA)與腸道菌群分布的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)分析可以得知,短鏈脂肪酸中(乙酸、丙酸、丁酸)與腸道菌群的變化量存在相關(guān)性，如表4。其中,雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、小類桿菌屬(Dialister)、普拉梭菌屬(Faecalibacterium)、克雷菌屬(Klebsiella)、巨單細(xì)胞菌屬(Megamonas)、薩特氏菌屬(Sutterella)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、巨球型菌(Megasphaera)與乙酸、丙酸、丁酸存在顯著正相關(guān)。說明這些菌屬會(huì)促進(jìn)短鏈脂肪酸的生成,如雙歧桿菌屬等有益菌會(huì)在腸道中分解消化糜中的碳水化合物以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)產(chǎn)生短鏈脂肪酸,短鏈脂肪酸不但可以為上皮細(xì)胞提供能量來源,同時(shí)可以降低腸道pH,抑制炎癥的發(fā)生,這就在代謝產(chǎn)物的角度驗(yàn)證了益生菌的益生作用所在。但艾克曼菌屬(Akkermansia)、擬桿菌屬(Bacteroides)、噬膽菌屬(Bilophila)、布勞特氏菌屬(Blautia)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、梭菌屬(Dorea)、埃希式菌屬(Escherichia)、副桿菌屬(Parabacteroides)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)和瘤胃球菌屬(Ruminoccus)、顫螺菌屬(Oscillospira)等則與短鏈脂肪酸呈負(fù)相關(guān),這說明短鏈脂肪酸抑制了抑制致病菌埃希氏菌屬等致病菌的增殖。Pan等[27]研究表明益生菌(雙歧桿菌屬)的生長與SCFA的生產(chǎn)有關(guān),與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表4 發(fā)酵液中SCFA與腸道菌群分布之間的相關(guān)性系數(shù)分析表Table 4 Analysis table of correlation coefficient between SCFA in fermentation broth and intestinal flora distribution

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了全麥粉(WW)和精制小麥粉(RW)在體外對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果表明,WW較RW在成分組成上,膳食纖維和多酚等可被微生物發(fā)酵利用的成分含量顯著增加。體外添加小麥基質(zhì)發(fā)酵降低了腸道微生物多樣性,其中擬桿菌門相對豐度下降,厚壁菌門相對豐度升高,但明顯增加了短鏈脂肪酸的含量并調(diào)節(jié)了腸道菌群的物種組成。被腸道微生物發(fā)酵利用后產(chǎn)生WW比RW更多的短鏈脂肪酸,而短鏈脂肪酸又與雙歧桿菌屬、小類桿菌屬等一些益生菌有正相關(guān)作用,因此高含量的膳食纖維、多酚、短鏈脂肪酸與腸道菌群的豐度與多樣性有密切的交互作用。此外,與RW相比,WW升高了發(fā)酵液中氨基酸球菌屬、雙歧桿菌屬、噬膽菌屬、巨單胞菌屬、巨型球菌屬等的相對豐度,且益生菌雙歧桿菌屬相對豐度是精制小麥粉發(fā)酵的1.19倍;降低了脫硫弧菌屬、小類桿菌屬、埃希式菌屬、普斯菌屬和薩特式菌屬等的相對豐度,且致病菌-埃希氏菌屬相對豐度降低了52%。由于全麥粉(WW)較精制小麥粉(RW)具有更好的調(diào)節(jié)腸道菌群、保護(hù)腸道健康的作用,因此在面粉加工處理上如果較多地保留外層麩皮中可被腸道微生物利用的益生元成分,即可以提升小麥粉的健康價(jià)值。