脫脂椰蓉粉亞臨界水降解動力學及產物形態(tài)研究

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(海南大學食品學院,生物活性物質與功能食品開發(fā)重點實驗室,熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心,海南?？?570228)

椰子(CocosnuciferaL.)屬棕櫚科椰子屬,是重要的熱帶油料作物,為人類提供食物、飲料、纖維、木炭和其他健康產品[1]。椰子果中富含多種營養(yǎng)成分,具有多種保健功能和較高的經濟價值。椰子原產于亞洲東南部、印度尼西亞至太平洋群島,中國廣東南部諸島及雷州半島、海南、臺灣及云南南部熱帶地區(qū)均有栽培。脫脂椰蓉是全脂椰蓉經榨油后剩余的部分,含有大量的纖維素和其他營養(yǎng)物質,但目前脫脂椰蓉主要作為廢棄物,有效成分沒有被充分發(fā)掘利用,經濟效益低,不僅造成了生物質資源的嚴重浪費同時也造成了環(huán)境污染[2-3]。因此,如果將脫脂椰蓉進行深加工,降解其中難以消化的纖維,變廢為寶,這對脫脂椰蓉產業(yè)資源利用和增加經濟效益有著極為重要的意義。

亞臨界水是介于其沸點和臨界溫度之間,并維持在適當的壓力狀態(tài)下的水[4]。亞臨界水提法被廣泛應用于副產物處理和動物飼料[5]。水在亞臨界條件下具有與有機溶劑相似的性質,并且具有清潔無毒、反應速率快、轉化率高[6-7]的優(yōu)勢,是環(huán)境友好型新技術。目前,趙巖等[8]研究了秸稈超(亞)臨界水預處理與水解技術,李婧秋[9]對油棕果渣在亞臨界水中的降解動力學做了評估,李幼梅[10]對番木瓜籽粕在亞臨界水中的降解過程進行了研究、徐明忠等[11]研究了農業(yè)廢棄物在亞臨界降解過程中液態(tài)水水解動力學。但國內外尚未有脫脂椰蓉在亞臨界水中降解的相關報道。本文通過對脫脂椰蓉亞臨界水無催化降解過程研究,建立其動力學模型,得到降解過程中降解速率常數,以及降解過程的活化能,研究其降解途徑,以期實現最大化利用脫脂椰蓉資源,提高產業(yè)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂椰蓉粕 由海口市大白康健醫(yī)療有限公司提供;葡萄糖 西隴科學股份公司;3,5-二硝基水楊酸 分析純,上海麥克林生化科技有限公司;混合單糖標準品:甘露糖,核糖,鼠李糖,氨基葡萄糖,葡萄糖醛酸,半乳糖醛酸,氨基半乳糖,葡萄糖,半乳糖,木糖,阿拉伯糖 Sigma公司。

HB43-S水分測定儀 梅特勒托利多儀器有限公司;723PC型可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司;AII研磨機 廣州儀科實驗室技術有限公司;EL204型電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司;CS101-1B電熱鼓風干燥箱 重慶四達試驗設備有限公司;PHS-3D pH計 上海精密科學儀器有限公司;Agilent 1100高效液相色譜儀,配DAD檢測器 安捷倫科技有限公司;亞臨界設備 由課題組自行設計,其裝置如圖1所示,該裝置分為溫度控制系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)和高溫反應釜。溫度控制系統(tǒng)是可控硅調溫器,配有高靈敏度溫度探頭,控溫精度±1 ℃;加熱系統(tǒng)(石棉加熱套)最高加熱溫度為300 ℃;高溫反應釜(不銹鋼材料),內含量定做的為150 mL,最高可承受400 ℃的高溫以及10 MPa壓力。

圖1 亞臨界裝置簡圖Fig.1 The scheme of subcritical water experiment device注:1:控溫儀;2:溫度探頭;3;壓力表;4:高壓閥門;5:反應釜;6:加熱套。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂椰蓉粉的制備 脫脂椰蓉粕置于45 ℃烘箱中干燥24 h,粉碎得到粉末即為脫脂椰蓉粉,取250 μm(60目)的部分裝入密封袋中,作為實驗原料樣品,置于12 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脫脂椰蓉粉成分測定 灰分測定:GB 5009.4-2016,水分測定:GB 5009.3-2010,纖維素、半纖維素、木質素測定:范式Van Soest分析法[12]。

1.2.3 脫脂椰蓉粉的亞臨界降解 精確稱取脫脂椰蓉粉2 g,放入亞臨界反應釜中,按質量體積比1∶30(按經濟、能源角度和水解率綜合考慮)加蒸餾水,密封反應釜。設置加熱套至實驗所需溫度,溫度達到后將反應釜放入,等反應釜溫度升至設定溫度(100、120、140、160、180和200 ℃)后,計時,待反應時間(10、20、30、40、50和60 min)達到后,將反應釜取出放入冷水(4 ℃)中迅速冷卻,反應后固液混合物,過濾分離得到降解液和降解產物,降解液進行真空抽濾,測其濾液的pH及還原糖濃度;降解產物于45 ℃烘箱中干燥24 h后稱重,記錄。

1.2.4 產物還原糖的測定

1.2.4.1 3,5-二硝基水楊酸(DNS)反應液的制備 準確稱取3,5-二硝基水楊酸6.3 g,加2 mol/L的NaOH 260 mL,搖勻后加入酒石酸鉀鈉水溶液(370 g/L),5 g亞硫酸鈉和5 g苯酚(60 ℃水浴下進行),最后定容至1000 mL,暗處存放7 d后使用[13]。

1.2.4.2 葡萄糖標準溶液的繪制 取0.1 g葡萄糖定容至100 mL,得到濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。取6支試管,分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL葡萄糖標準溶液,蒸餾水補足至1 mL,加入1.5 mL DNS試劑,補足至3 mL,搖勻后,沸水浴反應5 min,反應結束后冷卻至室溫,加入7 mL蒸餾水于540 nm處測吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線,標準曲線為y=0.83714x+0.0905,決定系數R2=0.995,線性范圍在0～0.5 mg/mL。

1.2.4.3 還原糖產率的計算 將降解后的濾液稀釋10倍,取1 mL加入1.5 mL DNS試劑,補足至3 mL,搖勻后,沸水浴反應5 min,反應結束后冷卻至室溫,加入7 mL蒸餾水于540 nm處測吸光值。根據標準曲線計算降解液中還原糖產率(Ys):

式(1)

式中:n-稀釋倍數;c-還原糖濃度(g/L);v-降解液體積(mL);m0-脫脂椰蓉殘渣中半纖維素含量(g);1000-單位換算。

1.3 動力學模型建立

由于高溫液態(tài)水表現出一定的酸催化特性,半纖維素在高溫液態(tài)水中水解為一級連串反應,半纖維素首先水解為聚糖,然后進一步分解為單糖,當反應條件劇烈時被進一步降解為糠醛等副產物,所以用稀酸催化水解半纖維素的動力學模型來表示[14]。

目前,國內外研究者利用Saeman模型對木質纖維素類生物質進行亞臨界水降解研究[15-17],主要發(fā)生以下反應:

半纖維素→低聚糖→單糖→降解物

式(2)

該模型是目前最常用的植物水解動力學模型,在動力反應計算時,將得到還原糖的量作為水解生成糖的總量,建立一級連串均相反應模型:

式(3)

式中:k1-脫脂椰蓉粉降解為還原糖的反應速率常數(min-1),k2-還原糖分解的反應速率常數(min-1)。反應速率方程如下:

式(4)

式(5)

式(6)

式中:Ch-脫脂椰蓉粉半纖維素濃度(g/L),Cs-還原糖濃度(g/L),Cd-還原糖降解產物的濃度(g/L)。

根據質量守恒定律:

Ch+Cs+Cd=Ch0

式(7)

式(8)

式(9)

式中:Ch0-脫脂椰蓉半纖維素降解前的初始濃度(g/L)。

可算出: Ch=Ch0exp(-k1t)

式(10)

式(11)

設t=0時,Cs=0,整理得:

式(12)

則還原糖產率為:

式(13)

1.4 動力學參數的確定

將脫脂椰蓉粉降解實驗數據Ch、Cs、Cd帶入方程(13),通過曲線擬合求解得出100、120、140、160、180、200 ℃的速率常數k1和k2。將k1和k2代入Arrhenius方程[18]:

式(14)

式中:Ki0-指前因子(min-1),Eai-反應活化能(kJ/mol),R-氣體常數,8.314J/(mol·K),T-降解溫度(K)。

方程兩邊取對數:lnKi=lnKi0-Eai/(RT),可以看出lnKi與1/T是線性關系的。對lnKi與1/T做一條擬合的直線,得到擬合直線方程。方程的截距為指前因子Ki0,斜率為反應活化能Eai。

1.5 脫脂椰蓉降解物形態(tài)學表征方法

1.5.1 固體殘渣轉化率 經亞臨界降解后,抽濾使固液分離,計算脫脂椰蓉粉在不同降解溫度及降解時間下的轉化率。

固體殘渣率:

式(15)

脫脂椰蓉粉轉化率:

Yt=1-Ym

式(16)

式中:m-降解后固體殘渣質量(干燥),g;M-原料質量,g。

1.5.2 掃描電鏡樣品的制備(SEM) 分別取不同降解溫度及降解時間下的適量脫脂椰蓉粉和亞臨界降解的脫脂椰蓉殘渣樣品,反應溫度為均勻分散在導電板上,用IB-5型離子濺射儀噴金鍍膜,對不同處理條件下的樣品進行微觀結構觀察。

1.5.3 紅外光譜分析 分別準確稱取干燥的脫脂椰蓉粉和160 ℃,30 min下的降解產物各1 mg于瑪瑙研缽中,加入100 mg干燥的KBr晶體,在紅外燈照射下研磨至極細混勻,用壓片機壓片,制成一定直徑和厚度的透明片,于紅外分光光度計400～4000 cm-1中紅外區(qū)掃描,測定紅外光譜曲線。

1.6 脫脂椰蓉降解產物分析

1.6.1 HPLC-單糖組成 脫脂椰蓉粉及降解物(160 ℃降解30 min)單糖組成經高效液相色譜分析后,先轉化為1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生物,采用Honda等[19]的方法進行單糖分析。

取濃度為250 mg/L的混合單糖標準液400 μL于5 mL的具塞試管中,加400 μL PMP甲醇溶液,漩渦混勻;于70 ℃水浴中反應2 h;取出冷卻至室溫;加400 μL 0.3 mol/L的鹽酸中和;加200 μL蒸餾水,再按1∶1等體積加入氯仿,渦旋混勻振搖,靜置后棄去氯仿相,萃取2次;將水相用0.45 μm微孔膜(水系)過濾后供HPLC進樣分析。

1.6.2 樣品水解液的制備 稱取10～20 mg降解液于10 mL的鉗口瓶中,加入5 mL的2 mol/L TFA,充N2封管,在110 ℃烘箱中水解6 h;冷卻后開蓋取2 mL加入1 mL甲醇于70 ℃水浴下用N2吹干,重復加甲醇并用N2吹干2次(去除TFA);加入2 mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解殘渣,即為樣品多糖水解液。

1.6.3 HPLC檢測條件 色譜條件:色譜柱C18柱,250 mm×4.6 mm,粒度5 μm;流動相A:100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH=6.4);流動相B:乙腈;檢測波長:250 nm;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;進樣量5 μL。

1.6.4 降解液pH 測試前校正pH計,測定降解液的pH。

1.7 數據統(tǒng)計分析

采用Excel 2010軟件進行統(tǒng)計處理,所有數據為3次重復的平均值和標準差。采用Origin軟件進行繪圖,并應用DPS軟件對數據進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 脫脂椰蓉粉成分分析

由表1可知,脫脂椰蓉粉中半纖維素質量分數由34.75%降至10.90%,木質素質量分數由7.89%降至7.44%,而纖維素的質量分數則由27.5%升至60.2%,由此可說明脫脂椰蓉粉經亞臨界處理主要破壞的是半纖維素和木質素,木質素為芳香族環(huán)狀化合物,結構破壞后不能直接轉化為還原糖,而半纖維素由于其結構同時含有五碳糖和六碳糖的雜多糖,可部分轉化為還原糖[20]。

表1 樣品的主要成分(%)Table 1 Main components of the samples(%)

2.2 亞臨界水降解動力學參數的確定

2.2.1 還原糖產率測定結果 不同溫度下脫脂椰蓉粉亞臨界水中降解還原糖產率實驗值(Experimental value,Exp)與計算值(Calculated,Cal)隨時間的變化如圖2所示。由圖2可以看出,反應溫度和降解時間還原糖產率有明顯影響。在100和120 ℃圖中還原糖產率隨著降解時間的增大而增大,降解溫度140 ℃時還原糖產率先增加后呈現平緩的趨勢,當降解溫度為160 ℃及更高時,還原糖的產率先隨降解時間增大而增大,達到峰值后隨降解時間的增大而降低。原因是高溫條件下脫脂椰蓉粉成分中的半纖維素在較短時間內就完成降解,而后還原糖產量下降可能是脫脂椰蓉粉成分中的半纖維素基本降解完全,此時的溫度又不足以打斷纖維素的糖苷鍵,因此反應過程中還原糖生成量低于還原糖降解量[5]。

圖2 不同溫度下的還原糖產率Fig.2 Yield of reducing sugar at different temperature

從圖中還可看出反應溫度在140、160、180和200 ℃時,還原糖產率都達到峰值,且峰值大致相同,達到峰值的時間隨溫度升高而增快。相同反應時間下,180和220 ℃還原糖產率達到峰值的時間太快,且保持時間短,因此在實際生產中選取反應溫度為160 ℃。

在本實驗考察的反應溫度下,實驗點與模型計算值的吻合度高,其中160 ℃下模型擬合所得曲線與實驗值擬合度R2>0.98,說明用Saeman模型作為脫脂椰蓉的降解動力學模型是合理的,半纖維素的降解行為遵循一級連串反應動力學模型。

2.2.2 動力學模型參數的確定 將k1,k2實驗數據代入Arrhenius方程,得到lnKi與1/T的擬合直線。如圖3所示。

表2 脫脂椰蓉不同溫度下亞臨界水降解的k1,k2值Table 2 Values of k1 and k2 under different temperature of defatted coconut flour fiber in subcritical water

圖3 脫脂椰蓉粉亞臨界水降解lnk與1/T的關系Fig.3 Defatted coconut flour in subcritical water degradation lnk relationship with 1/T

取擬合直線方程的截距和斜率用做求指前因子Ki0和反應活化能Eai,結果如表3所示:

表3 亞臨界水降解脫脂椰蓉粉的指前因子和反應活化能Table 3 Finger-leading factors and reactive activation energy of defatted coconut flour fiber in subcritical water

表3中的數據代入Arrhenius方程得:

K1=6.50×102exp[-35.94×103/RT]

K2=3.24×102exp[-32.12×103/RT]

2.3 溫度與時間對脫脂椰蓉粉轉化率的影響

由圖4可知,亞臨界水的溫度對脫脂椰蓉粉的轉化具有非常明顯的影響,在降解時間10 min,溫度由100 ℃升至200 ℃時,脫脂椰蓉粉轉化率由23.0%升高至56.2%,轉化率提高了59.07%。在降解時間60 min,溫度由100 ℃升至200 ℃時,脫脂椰蓉粉轉化率由34.01%升高至76.20%,轉化率提高了55.38%。由此可知,反應溫度升高可提高轉化率。

圖4 降解溫度和時間對脫脂椰蓉粉轉化率的影響Fig.4 Effects of degradation temperature and time on defatted coconut flour fiber conversion

在反應溫度為100 ℃時,反應時間由10 min延長至60 min時,轉化率由 23.0%升高至60.34%,轉化率提高了61.88%。由此可知,延長反應時間也可提高轉化率。據上述,不同反應溫度下,溫度越高,轉化率越大,相同反應溫度條件下,延長反應時間可提高轉化率。

2.4 脫脂椰蓉殘渣亞臨界水降解過程形態(tài)學變化

2.4.1 不同降解溫度和時間的掃描電鏡變化 在反應時間為30 min,料液比為1∶30的固定條件下,得到原樣和100～200 ℃ 溫度降解后的固態(tài)產物表觀形態(tài)學,如圖5所示:

圖5 脫脂椰蓉粉及其各降解時間固態(tài)產物的掃描電鏡圖(1000×)Fig.5 SEM of defatted coconut flour fiber and it’s degradation products in different time in subcritical water(1000×)

由圖5可知,經100 ℃降解后的固態(tài)產物開始產生縫隙,覆蓋在表面的片狀結構物開始出現剝落現象,并開始形成早期骨架連接物的雛形。120 ℃表面開始變的不再光滑,形成具有孔狀的骨架連接物。140 ℃固態(tài)產物形態(tài)中的骨架連接物的骨架之間有斷開狀,斷口呈無規(guī)則狀,孔洞多而繁密。160 ℃固態(tài)產物的骨架狀物質變得稀薄;180 ℃固態(tài)產物呈稀疏、斷層的無規(guī)則狀;200 ℃的固態(tài)產物中的骨架連接物斷裂,呈稀碎、無規(guī)則堆積狀。

在反應溫度為160 ℃,料液比為1∶30的固定條件下,得到原樣和10～60 min降解時間后的固態(tài)產物表觀形態(tài)學,如圖6所示:

圖6 脫脂椰蓉粉及其各溫度降解后固態(tài)產物的掃描電鏡圖(1000×)Fig.6 SEM of defatted coconut flour fiber and it’s degradation products in different temperature in subcritical water(1000×)

圖6為脫脂椰蓉粉與降解物進行微觀形態(tài)學的對比圖,由圖可知,不同降解時間下固態(tài)產物呈現的表觀形貌不同。反應10 min時,片狀結構物開始聚集,表面凹凸物初步剝落,表面變的光滑,反應20 min時,生成骨架連接物,并開始出現孔洞。反應30～40 min時,可觀察到物質結構開始模糊,有融合團聚現象。反應50 min時,骨架連接物斷裂,孔洞開始增多而密,完整的斷裂骨架物基本上被打成小碎片;反應60 min時,物料之間堆積較疏松,稀碎,松散。

對比脫脂椰蓉粉原樣,經不同溫度亞臨界降解后的樣品結構均發(fā)生了不同程度的改變,溫度越高,骨架連接物之間開始斷裂,演變成骨架稀薄、并出現孔洞,最終形成稀碎、無規(guī)則形狀的堆積物。實驗結果表明,脫脂椰蓉粉在亞臨界水中發(fā)生了降解。

2.4.2 脫脂椰蓉粉及降解物的紅外光譜圖 為進一步分析亞臨界水對脫脂椰蓉粉與降解物結構的影響,對脫脂椰蓉粉和降解物(160 ℃降解30 min)做了紅外光譜實驗。由圖7(b)可知,在 808、1012、1240、1452、2328 cm-1處的特征吸收峰消失,在607、650、1508、1321、1541、1571、2368、3371.57 cm-1處出現了新的特征吸收峰,據此可知,脫脂椰蓉粉在亞臨界水中發(fā)生了降解反應。

圖7 脫脂椰蓉原樣及降解產物的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectrogram of defatted coconut flour and degradation products注:a:原料;b:降解產物。

其中,1541.12和1452 cm-1處是木質素結構中苯環(huán)的吸收峰,說明表示樣品中存在芳香族類有機物;2924.09 cm-1處有一較強吸收峰,此峰為糖類亞甲基上C-H的伸縮振動;1456.26 cm-1處的小尖峰是O-H的變形振動,1246.02、1321.21、1377.17 cm-1處為C-H的變角振動,這些峰都是糖類的特征吸收峰;1747.51 cm-1處為半纖維素C=O的伸縮振動,1157 cm-1處是半纖維素和木質素的C-O-C伸縮振動,1060 cm-1是半纖維素和纖維素中C-O的伸縮振動;806.26、871.82 cm-1處表明降解物中含有a-型吡喃糖[21-23]。

2.5 脫脂椰蓉粉降解產物分析

2.5.1 單糖組分分析 對脫脂椰蓉粉和降解物(160 ℃降解30 min)做單糖組分的分析,結果如圖8所示:

圖8 脫脂椰蓉粉及其降解后固態(tài)產物的單糖組成Fig.8 Monosaccharide composition of defatted coconut flour and it’s degradation products

由圖8可知,經亞臨界降解后,降解產物單糖的絕對含量發(fā)生了顯著的變化,獲得富含纖維素的殘渣。經降解后的單糖主要有甘露糖和半乳糖組成。其中鼠李糖半乳糖醛酸、氨基半乳糖、木糖經亞臨界水降解后消失,甘露糖由原料中的502.38 mg/L升高至848.49 mg/L,核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、半乳糖、阿拉伯糖的絕對含量均有大幅度下降,分別由506.87、463.48、499.26、499.98、471.94 mg/L下降到27.01、19.74、69.05、333.11、50.97 mg/L。這可能是因為有一部分在亞臨界水條件下難以水解的纖維組織中所含單糖的組成與原料中的不同所致。

2.5.2 降解液pH變化 由圖9可知,降解液的pH隨著降解時間的延長,而逐漸下降;在前10 min內下降趨勢明顯,而后漸變平緩。溫度越高,pH下降的速率越快,這是因為亞臨界條件下隨溫度升高,水分子間的相互作用越強烈,從而加速催化降解反應速率,溫度越高,催化越明顯,降解速率越大。pH下降的原因是因為脫脂椰蓉殘渣的半纖維素中含有乙酰基團,反應初期水解產生了大量乙酸[24-26]。

圖9 降解液pH變化Fig.9 Changes of pH of hydrolysate

3 結論

Saeman模型擬合相關系數較高,能很好地反映了脫脂椰蓉粉亞臨界水降解的途徑。在亞臨界水解條件下脫脂椰蓉纖維降解反應活化能為35.94 kJ/mol,還原糖降解活化能為32.12 kJ/mol,指前因子分別為6.50×102和3.24×102。降解產物形態(tài)學可知,在不同的亞臨界水條件下,脫脂椰蓉粉轉化率不同,反應溫度越高,可縮短降解時間,反應溫度低可通過延長反應時間提高轉化率,在SEM下降解后的產物隨亞臨界水降解溫度的提高堆疊程度疏松,演變成骨架稀薄的薄膜狀;降解物的紅外結構顯示了多糖的典型特征。