河源地區(qū)3879例非綜合征型耳聾致病基因突變分析

劉曉燕，鄔麗紅，曾秋娜，劉運華

(河源市婦幼保健院檢驗科，廣東 河源 517000)

遺傳性耳聾屬于常見的先天性疾病，多因單一基因突變或不同基因的復合突變引起，醫(yī)療、環(huán)境、創(chuàng)傷、藥物等為主要的客觀誘發(fā)因素[1]。遺傳性耳聾具有較高的發(fā)病率，是威脅人們健康的重要疾病之一。相關(guān)調(diào)查[2]數(shù)據(jù)顯示，在我國殘疾人口中，超過2780萬為聽力殘疾者，占全國8296萬殘疾人的31%，占世界聽障人群的25%。另有數(shù)據(jù)[3]調(diào)查顯示，世界各國每新出生1000名新生兒，便有1名為先天性耳聾患兒。在此背景下，必須加強遺傳性耳聾的防治工作，以降低遺傳性耳聾的發(fā)病率。因此，加強對遺傳性耳聾相關(guān)致病因素的分析至關(guān)重要。本研究納入河源市婦幼保健院2018年7月至2019年6月的3879例非綜合征型耳聾患者，分析致病基因突變情況。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

3879例非綜合征型耳聾患者，男2094例(53.98%)，女1785例(46.02%)，其中3847例是新生兒，采集的標本有90%以上是臍帶血。根據(jù)患兒的發(fā)病情況、病史和全面的影像學檢查結(jié)果，結(jié)合病狀表現(xiàn)和體征，均確診為非綜合征耳聾。排除聽力下降外伴有其他臨床癥狀者和綜合征型耳聾患者。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)物品

全血基因組提取試劑盒購自潮州凱普生物化學有限公司，PCR-導流雜交法耳聾易感基因檢測試劑盒(離心柱型)、PCR擴增儀ABI7300購自美國賽默飛世爾科技公司，醫(yī)用核酸分子快速雜交儀HHM-2、核酸分子雜交儀HB-2012A購自廣東凱普生物科技股份有限公司。

1.2.2 DNA分離提取

患者或其監(jiān)護人獲悉耳聾相關(guān)知識后，抽取被檢測者臍帶血或外周靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，取血液100 μL，采用凱普全血基因組提取試劑盒(離心柱型)提取基因組DNA,使用分光光度計檢測純度，滿足OD260/280=1.7～2.0，取2 μL抽提好的DNA樣本作為模板進行PCR擴增，剩余DNA樣品保存于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 PCR-導流雜交法

對標本破裂細胞膜以釋放DNA，在高濃度鹽溶液中將核酸吸附在硅類介質(zhì)表面，并在低鹽濃度中將洗脫下來的DNA進行PCR擴增，GJB2、GJB3、mtDNA和SLC26A4基因引物參考相關(guān)文獻[3-4]設計。1)擴增體系：2組PCR混合液各27.5 μL，主要成分包括Buffer、dNTPs、氯化鎂；Taq酶1 μL(5 U·μL-1)，ddH2O(50 mL)。擴增程序：①95 ℃變性 9min；②95 ℃變性30 s，55 ℃溫度下退火30 s，72 ℃延伸60 s，40個循環(huán)；③72 ℃延伸5 min；降溫至16 ℃擴增完成。2)雜交體系：雜交液(SSC、0.1%SDS),洗脫液WBI(SSC、0.1%SDS)，封阻液(TBS、脫脂奶粉、吐溫-20)，酶標液(鏈霉親和素堿性磷酸酶)，溶液A(TBS、吐溫-20)，雜交膜(氨基化探針、尼龍膜)，顯色液(NBT/BCIP)。雜交過程：①95 ℃變性5～10 min，冰水浴至少2 min；②45 ℃導流雜交。3)顯色分析結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS12.0軟件處理數(shù)據(jù)，比較采用χ2檢驗，以P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 非綜合征型耳聾致病基因檢測結(jié)果

3879例非綜合征型耳聾患者中，檢測出致病基因攜帶患者148例，檢出率為3.82%。

2.2 各種攜帶基因突變攜帶情況的分析

在致病基因攜帶率方面，GJB2和SLC26A4高于GJB3和mtDNA，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；GJB2和SLC26A4相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；GJB3和mtDNA相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各種攜帶基因突變攜帶情況的分析

3 討論

50%患兒的耳聾與遺傳因素有關(guān)，70%的遺傳性耳聾不伴有其他癥狀，稱為非綜合征性耳聾；非綜合征耳聾是最常見的感音神經(jīng)性聾，可以分為四類，分別為線粒體遺傳性耳聾(1%)、性連鎖(DFN X-linked，1%)、常染色體顯性(DFNA，15%～20%)和常染色體隱性(DFNB，80%)[5]。相關(guān)研究[6]表明，絕大部分的遲發(fā)性聽力下降患者中，其致病因素中包括自身基因缺陷所致，或由于基因缺陷和多態(tài)性造成對致聾環(huán)境因素易感性增加而致病。我國遺傳性耳聾患者所涉及的主要是線粒體DNA(mtDNA)、SLC26A4、GJB2和GJB3 4種基因的突變。其中，mtDNA基因突變主要包括1494M、1555M、7445M和12201M；SLC26A4基因突變主要包括IVS-M、1229M、2168M；GJB2基因突變主要包括35M、155M、176M、235M和299M；GJB3突變主要以538M為主。

遺傳性耳聾有很高的遺傳異質(zhì)性，與耳聾相關(guān)的基因至少有100個，這給臨床檢測帶來了很大的困難。目前，傳統(tǒng)基因診斷方法中。酶切、限制性片段長度多態(tài)性分析、變性高效液相色譜分析等是較為常見的診斷方法，盡管具有良好的診斷效果，但是也存在相應的局限，如不能定性、耗時費力、所需設備和耗材昂貴等，最為重要的是難以同時對不同基因的多個突變位點進行檢測[7]。以APEX、Invader等芯片檢測技術(shù)為例，可以同時針對數(shù)百個突變位點進行高通量檢測，但檢測周期最長可達8周，而且檢測成本相對較高，對除點突變之外的其他突變類型的檢出能力有限，PCR-導流雜交法采用生物素標記的引物分別對耳聾基因突變區(qū)域進行特異性擴增，將擴增產(chǎn)物與標記不同突變類型耳聾基因探針的尼龍膜在導流雜交儀上進行導流雜交，然后通過化學顯色對結(jié)果進行判讀[8]。

本研究針對PCR-導流雜交技術(shù)檢測河源地區(qū)4種耳聾易感基因，通過分析被檢者的DNA，確認與耳聾相關(guān)的基因是否存在，取得了理想的效果。研究結(jié)果顯示，經(jīng)PCR-導流雜交法檢測出致病基因攜帶患者148例，檢出率為3.82%。進一步分析各基因突變攜帶率，發(fā)現(xiàn)GJB2和SLC26A4攜帶率比較高，均超過了40%，并且遠高于GJB3和mtDNA的攜帶率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這可為耳聾的臨床診斷提供依據(jù)，對致聾基因的尋找和檢測有著重要的意義。

綜上所述，河源地區(qū)非綜合征型耳聾患者中，GJB2和SLC26A4突變基因的攜帶率比較高，GJB3和mtDNA基因突變的攜帶率較低，加強對該地區(qū)非綜合征耳聾患者致病基因突變的分析，了解該地區(qū)耳聾基因的突變譜，可為該地區(qū)乃至全國耳聾基因型分布提供數(shù)據(jù)支持，同時也為耳聾的早期診斷和治療提供參考。