Wnt3a、SFRP1、NLRP3及IL-1β聯(lián)合檢測(cè)對(duì)慢性牙周炎感染的診斷價(jià)值分析

趙芳，黃婷，李娟

(鄭州市第一人民醫(yī)院口腔科，河南 鄭州 450000)

流行病學(xué)研究顯示，慢性牙周炎的發(fā)病率具有進(jìn)一步的上升趨勢(shì)[1]。臨床上慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展能夠?qū)е卵乐艽男纬?，促進(jìn)牙齒的松動(dòng)，增加失牙的風(fēng)險(xiǎn)。不同的生物學(xué)因子特別是炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，能夠通過(guò)影響成纖維細(xì)胞的凋亡，降低結(jié)締組織的張力及支持功能，促進(jìn)慢性牙周組織的炎癥性疾病的發(fā)生。Wnt[2]信號(hào)通路的激活能夠通過(guò)維持局部自身免疫因子的表達(dá)，提高局部牙周組織的抗炎癥損傷能力；分泌型卷曲相關(guān)蛋白 1(secreted frizzle.relatedprotein 1，SFRPl)的表達(dá)能夠通過(guò)調(diào)控Wnt3a信號(hào)通路的激活，從而抑制Wnt3a信號(hào)通路的上調(diào)，提高下游單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞對(duì)于牙周組織的浸潤(rùn)[3]；不同的炎性小體均能夠影響到組織損傷的發(fā)生過(guò)程，而其中炎癥小體（NLRP3）近年來(lái)被認(rèn)為顯著影響到了口腔炎癥性疾病的發(fā)生過(guò)程，NLRP3的上升能夠?qū)е卵乐芙M織細(xì)胞的膜完整性的破壞，導(dǎo)致牙周支持結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致慢性牙周損傷[4，5]。為了進(jìn)一步揭示 Wnt3a、SFRP1、NLRP3 及 IL－1β 等在慢性牙周炎中的表達(dá)情況，從而為慢性牙周炎的早期診斷提供依據(jù)，本次研究選取我院口腔科2016年10月至2017年10月收治的90例CP感染患者作為研究組，探討了相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)及其與患者病情的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院口腔科2016年10月至2017年10月收治的90例CP感染患者作為研究組，男 42 例，女 48 例，年齡 25～50 歲，平均(33.85±3.14)歲。按其附著喪失(CAL)程度將患者分為輕中重3個(gè)等級(jí)。另選取該時(shí)段來(lái)我院體檢的90例健康者作為對(duì)照組，其中男33例，女57例，年齡25～50 歲，平均(30.17±3.82)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)檢查確診為慢性牙周炎感染的患者；②半年內(nèi)未服用過(guò)抗生素、免疫抑制劑藥物者；③患者及家屬知情同意并配合治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕等全身性系統(tǒng)疾病者；②長(zhǎng)期吸煙酗酒者；③合并惡性腫瘤、嚴(yán)重心肝腎疾病的患者；④月經(jīng)、妊娠或哺乳期婦女；⑤精神病患者。

1.2 檢測(cè)方法 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)Wnt3a、SFRPl和 IL－1β、NLRPS 的含量：采集齒齦溝液體 3ml，加入 Wnt3a、SFRPl和 IL－1β、NLRPS 單抗，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的Wnt3a、SFRPl和 IL－1β、NLRPS 會(huì)與單抗結(jié)合，PBS液體洗滌5min。按照1：500的比例加入羊標(biāo)志的一抗5ml，4℃放置過(guò)夜，PBS緩沖液洗滌3 次，每次 5min，加入鼠來(lái)源的二抗（1：1000）2ml，室溫放置2h，PBS液體洗滌5min。加入顯色底物，辣根過(guò)氧化物酶會(huì)使無(wú)色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450nm處測(cè)OD值。

采用RT－PCR檢測(cè)Wnt3a水平：在提取液體中加入 0.2ml的氯仿，2℃～8℃冰凍離心機(jī)中離心(12000g/min，15min)，反復(fù)一次洗滌 RNA，棄上清，在管底部可見(jiàn)一乳白色小沉淀物，加入1ml 75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC 使其終濃度均為 20pmol/ul，制備反應(yīng)體系，RT－PCR擴(kuò)增的條件與參數(shù)：48℃，45min，94℃，2min；94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min 共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)完畢后68℃延伸7min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 選用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)；組間比較采用t檢驗(yàn)；P值＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組牙周組織中Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，研究組Wnt3a的mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（0.41±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。研究組Wnt3a蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（0.39±0.28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 兩組牙周組織中Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的表達(dá)水平比較

2.2 不同CAL程度患者SFRPl的濃度比較 與對(duì)照組相比，除輕度牙周炎患者外，中、重度患者的SFRPl濃度均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。 見(jiàn)表 2。

2.3 兩組牙周膜細(xì)胞中NLRP3及IL－1β的表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，研究組牙周膜細(xì)胞中NLRP3和 IL－1β 表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 不同CAL程度患者SFRPl的濃度比較

表3 兩組牙周膜細(xì)胞中NLRP3及IL-1β的表達(dá)比較（pg/ml）

3 討論

現(xiàn)階段臨床上慢性牙周炎的發(fā)生率具有顯著的上升趨勢(shì)，特別是在合并有糖尿病、高血壓或者自身免疫性疾病的人群中，慢性牙周炎的發(fā)病均具有進(jìn)一步的上升趨勢(shì)。臨床上慢性牙周炎的發(fā)生能夠增加患者遠(yuǎn)期牙周組織的破壞和牙齒脫落的風(fēng)險(xiǎn)[6]。但慢性牙周炎的早期診斷水平較低，臨床早期多不具有顯著的臨床癥狀，診斷較為困難，口腔內(nèi)鏡檢查等的費(fèi)用偏高且難以廣泛開(kāi)展。血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)在感染性疾病的診斷過(guò)程中發(fā)揮了重要的參考作用，其檢測(cè)較為方便、經(jīng)濟(jì)，可開(kāi)展性較高、容易普及。本次研究的現(xiàn)實(shí)意義在于：⑴能夠?yàn)榕R床上慢性牙周炎患者的早期診斷提供血清學(xué)參考指標(biāo)；⑵能夠?yàn)榕R床上慢性牙周炎的生物學(xué)治療提供理論基礎(chǔ)。

Wnt3a信號(hào)通路的激活能夠提高局部分泌型IgA的濃度，提高局部抗氧化或者抗病原體侵蝕的能力，特別是Wnt3a蛋白的表達(dá)上升能夠增加其巨噬細(xì)胞吞噬厭氧菌或者牙菌斑微結(jié)構(gòu)的能力，促進(jìn)病原體的清除[7]；SFRP1作為Wnt3a信號(hào)通路上重要的效應(yīng)因子，SFRP1的表達(dá)濃度的改變能夠拮抗Wnt3a的下游因子的激活作用，降低Wnt3a對(duì)于局部牙齦溝中液體微環(huán)境的保護(hù)作用[8]；NLRP3及IL－1β均是炎癥因子相關(guān)成分，NLRP3及IL－1β的表達(dá)上升能夠提高局部炎癥因子的富集程度，促進(jìn)局部趨化因子或者補(bǔ)體成分的激活，增加中性粒細(xì)胞酶對(duì)于牙周組織的分解作用，增加炎癥細(xì)胞對(duì)于牙周組織的浸潤(rùn)[9，10]。部分研究已經(jīng)探討了Wnt3a信號(hào)通路上部分因子在慢性牙周炎局部齒齦溝中的表達(dá)情況，認(rèn)為相關(guān)指標(biāo)的異常表達(dá)是促進(jìn)病情進(jìn)展、導(dǎo)致牙周組織破壞的重要因子，但對(duì)于SFRP1、NLRP3及IL-1β等的分析研究不足。

本次研究通過(guò)齒齦溝或者牙周組織細(xì)胞中的相關(guān)因子的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白在齒齦溝或者牙周組織細(xì)胞中的表達(dá)濃度均明顯上升，高于正常良性牙周組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示W(wǎng)nt3a mRNA及Wnt3a蛋白的異常表達(dá)可能影響到了慢性牙周炎的發(fā)生過(guò)程，相關(guān)指標(biāo)的高表達(dá)能夠通過(guò)影響Wnt3a信號(hào)通路的調(diào)控，促進(jìn)慢性牙周炎的發(fā)生[11-13]：⑴Wnt3a mRNA及Wnt3a蛋白的下降失去了對(duì)于下游游離狀態(tài)的體液因子的促釋放作用，導(dǎo)致牙周組織的自身抗凋亡能力的下降；⑵Wnt3a信號(hào)通路沉默導(dǎo)致的局部微環(huán)境的改變，能夠增加牙菌斑的形成風(fēng)險(xiǎn)，增加牙周組織成纖維成分的分解速度。程煥芝等[14]研究者在探討了72例慢性牙周炎患者的齒齦溝中的相關(guān)因子的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，Wnt3a蛋白陽(yáng)性表達(dá)率平均下降25%以上，同時(shí)患者的慢性牙周炎的病程越長(zhǎng)、牙周組織的破壞越為嚴(yán)重，Wnt3a蛋白的下降越為明顯。附著喪失是評(píng)估慢性牙周炎患者病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，在附著喪失越為嚴(yán)重的患者中，SFRPl的表達(dá)濃度上升越為明顯，提示了SFRPl與慢性牙周炎患者的病情密切相關(guān)，SFRPl能夠通過(guò)影響局部牙周組織中的金屬蛋白酶的活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)于患者牙周炎組織的破壞作用，提高牙周組織的分解及牙齒的破壞。采集病變較為明顯的牙周炎組織患者的病灶，檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)牙周膜細(xì)胞中NLRP3及IL-1β的表達(dá)濃度明顯上升，二者是評(píng)估患者體內(nèi)局部炎癥反應(yīng)程度的指標(biāo)，牙周膜細(xì)胞中NLRP3及IL-1β的表達(dá)上升提示了炎癥小體或者炎癥介質(zhì)在慢性牙周炎病情進(jìn)展過(guò)程中的重要作用。但部分學(xué)者并不認(rèn)為IL-1β的高表達(dá)具有普遍性，IL-1β的高表達(dá)主要與疾病的急性發(fā)作、牙齦短期內(nèi)破壞加劇、牙齦萎縮、牙槽骨的分解和侵蝕等過(guò)程有關(guān)[15]。

綜上所述，慢性牙周炎患者感染可引起牙周組織中Wnt3a蛋白表達(dá)下調(diào)，齦溝液中的SFRPl含量升高，牙周膜細(xì)胞中NLRP3及IL-1β表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明 Wnt3a、SFRP1、NLRP3 及 IL-1β 可能在促進(jìn)慢性牙周炎患者的病情進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。