磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)兒童IGF-1的方法學(xué)性能評(píng)價(jià)

李瑞，張耀東，趙鼎，孫紅啟，楊俊梅，李進(jìn)香

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院；河南省兒童遺傳代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州450018)

胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin like growth factor，IGF-1）也被稱作“生長(zhǎng)介素”，是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽，由肝臟和其它多種組織所分泌[1]，近年來(lái)很多研究表明[2-4]，IGF-1是聯(lián)系營(yíng)養(yǎng)和生殖的紐帶，是青春發(fā)育啟動(dòng)的重要信號(hào)之一。在嬰兒的生長(zhǎng)和在成人體內(nèi)持續(xù)進(jìn)行合成代謝作用上具有重要意義。臨床上已作為常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)判斷兒童骨骼生長(zhǎng)狀況。

磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法是檢測(cè)該項(xiàng)目的一種敏感、特異的快速檢測(cè)方法。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案和ISO15189等文件對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的管理要求和實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的要求[5，6]，檢測(cè)系統(tǒng)在用于臨床之前必須對(duì)其分析性能進(jìn)行驗(yàn)證。本研究通過(guò)AutoLumo A2000檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定IGF-1的分析靈敏度、分析內(nèi)精密度、分析間精密度、線性范圍、回收實(shí)驗(yàn)和參考區(qū)間，以驗(yàn)證廠商給定的性能參數(shù)，為臨床應(yīng)用該項(xiàng)目提供準(zhǔn)確、詳實(shí)、可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集我院2017年11月-12月就診患兒的新鮮血清標(biāo)本，按照要求分為高、低濃度，冰箱-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器和試劑 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀（AutoLumo A2000），胰島素樣生長(zhǎng)因子-1檢測(cè)試劑盒（豫械注準(zhǔn)20152400476）

1.3 方法

1.3.1 分析靈敏度 將試劑盒中零濃度校準(zhǔn)品（S0）重復(fù)測(cè)定10次，得出10次測(cè)量結(jié)果的RLU值（相對(duì)發(fā)光值），計(jì)算其平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M+2SD的RLU值，將M+2SD帶入lin-log擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為分析靈敏度。

1.3.2 分析內(nèi)精密度 按照CLSI EP5-A2文件要求[7]，選擇安圖公司配套的高、低值質(zhì)控品（批號(hào)：2017081601）作為精密度評(píng)價(jià)的樣本進(jìn)行檢測(cè)，1d內(nèi)連續(xù)測(cè)定10次，分別計(jì)算均值（x），標(biāo)準(zhǔn)差（S）和變異系數(shù)（CV）。

1.3.3 分析間精密度 將上述兩種濃度的混合血清每天測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定3d，分別計(jì)算均值（x），標(biāo)準(zhǔn)差（S）和變異系數(shù)（CV）。

1.3.4 線性范圍 按照CLSI EP6-A2文件要求[8]，取 IGF-1高值（H）和低值（L）血清各 1份，按 5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L 和 5L 稀釋，形成系列濃度血清進(jìn)行測(cè)定，以稀釋后的理論值為X，實(shí)測(cè)值為Y，將所有結(jié)果標(biāo)在坐標(biāo)圖上，計(jì)算回歸方程：Y=bX+a驗(yàn)證線性范圍，判斷標(biāo)準(zhǔn)為b值在0.97～1.03 范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù) R2≥0.9900。

1.3.5 回收實(shí)驗(yàn) 將高值混合樣本A（濃度為535.6745ng/ml）加入到低值混合樣本B（濃度為51.8905ng/ml）中，樣本A與樣本B的體積比例為1：4，配置成樣本 C（濃度為 105.983ng/ml），分別測(cè)量樣本A、B和C，各重復(fù)2次，計(jì)算平均值作為檢測(cè)值，比較實(shí)際檢測(cè)值和理論值的差異，計(jì)算回收率R，回收率應(yīng)在80～100%范圍內(nèi)。

1.3.6 干擾實(shí)驗(yàn) 按照CLSI EP7-P文件要求[9]，⑴溶血干擾物：取新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加蒸餾水配制，血紅蛋白(Hb)濃度分別為5、3、l g/L；⑵三酰甘油(TG)干擾物：取高血脂患者樣本加蒸餾水配制，TG濃度分別為12、6、3mmol/L；⑶膽紅素干擾物：取黃疸患者樣本加蒸餾水配制，總膽紅素(TBil)濃度分別為 150、100、50umol/L；⑷計(jì)算：低水平樣本和高水平樣本各分成2份，每份樣本重復(fù)測(cè)定5次計(jì)算分析干擾值：干擾值=T-C，即各組均值-未加干擾物相應(yīng)組的均值。干擾值在對(duì)照組1.96s(95%可信區(qū)間)范圍內(nèi)為無(wú)顯著干擾。

1.3.7 參考區(qū)間 選擇在線性范圍內(nèi)的高值樣本1份，用系統(tǒng)稀釋液按照說(shuō)明書(shū)最大稀釋倍數(shù)5倍進(jìn)行稀釋，測(cè)定原高值樣本和稀釋后樣本各2次，得出靶值(原值均值)和測(cè)定值（稀釋后樣本均值M×5），計(jì)算檢測(cè)值與靶值的相對(duì)偏倚（%）。偏倚=[（測(cè)定值-靶值）/靶值]×100%。

2 結(jié)果

2.1 分析靈敏度驗(yàn)證結(jié)果 10次S0發(fā)光值均值為178788，SD 為 54025，均值+2SD 為 286838，得出最低檢測(cè)限即分析靈敏度為5.81ng/ml。

2.2 精密度驗(yàn)證結(jié)果 分析內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果為低、高值樣品（CV%）分別為6.31%和5.65%；分析間精密度驗(yàn)證結(jié)果為低、高值樣品（CV%）分別為6.46%和8.09%。均小于廠商提供的數(shù)據(jù) （不大于10%）。見(jiàn)表1。

2.3 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果 選取IGF-1高濃度（839.653ng/ml）和低濃度（54.548ng/ml）血清，稀釋后的理論值和實(shí)測(cè)均值見(jiàn)表2，散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示 Y=1.027X-50.77，R2=0.9929。 b=1.027 在0.97～1.03 范圍內(nèi)，R2≥0.9900， 故 IGF-1 濃度在15～1000ng/ml范圍內(nèi)線性良好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果（ng/ml）

表2 線性范圍驗(yàn)證（ng/ml）

2.4 回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果 將高低值血清樣本按比例混合后上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)值和理論值計(jì)算回收率R為105.70%，見(jiàn)表3。

表3 回收率驗(yàn)證（ng/ml）

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果 TBil濃度高達(dá)150umol/L、TG濃度高達(dá)12mmol/L時(shí)，測(cè)定的IGF-1高、低水平樣本的干擾值均在干擾限度值 （1.96s）范圍內(nèi)，均不構(gòu)成干擾。而Hb低于5g/L時(shí)使IGF-l的濃度明顯下降。

圖1 IGF-1線性分析

2.6 參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果 原值兩次測(cè)定結(jié)果均值為737.5645ng/ml稀釋樣本兩次測(cè)定結(jié)果均值為140.8105ng/ml，偏差為-4.54%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求：偏差不大于±20%，試劑盒參考范圍可滿足15～5000ng/ml的要求。

3 討論

IGF是一類既有胰島素樣合成代謝作用，又有促生長(zhǎng)作用的單鏈多肽，血中90%的IGF-1由肝臟合成。目前發(fā)現(xiàn)，IGF有IGF-1和IGF-2兩種。IGF-1是GH依賴的生長(zhǎng)因子，IGF-1作為一個(gè)重要的有絲分裂原，在機(jī)體中的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，而IGF-2是重要的胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)節(jié)因子，GH的大部分生物學(xué)效應(yīng)是由肝、腎等組織依賴所產(chǎn)生的IGF-1介導(dǎo)[10，11]。生后隨年齡的增長(zhǎng)，IGF-1水平緩慢升高，直到青春發(fā)育前大致與成人相似，青春發(fā)育期IGF-1水平急劇升高，為成人水平2倍以上，持續(xù)幾年后下降，18歲以后達(dá)成人水平，50歲后呈緩慢下降的趨勢(shì)[12，13]。因此，臨床工作中常常用血清IGF-1水平來(lái)協(xié)助診斷生長(zhǎng)激素缺乏癥，或?qū)κ褂蒙L(zhǎng)激素治療的兒童進(jìn)行用藥的安全監(jiān)測(cè)和療效評(píng)估。

磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)IGF-1的原理是采用雙抗體夾心法。用抗人IGF-1抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的IGF-1會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IGF-1抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素。抗人IGF-1抗體與結(jié)合在包被抗體上的人IGF-1結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入發(fā)光底物混合液，發(fā)光底物在辣根過(guò)氧化物酶的催化下發(fā)出熒光，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光值（RLU），IGF-1濃度與化學(xué)發(fā)光值之間呈正相關(guān)，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IGF-1的濃度。

任何分析方法都存在一定的誤差，為保證高質(zhì)量的臨床實(shí)驗(yàn)室服務(wù)，對(duì)選定的方法經(jīng)過(guò)初步試驗(yàn)之后或用于臨床常規(guī)檢測(cè)之前以及在對(duì)原有檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行修改后，實(shí)驗(yàn)室須對(duì)該方法進(jìn)行嚴(yán)格、系統(tǒng)的技術(shù)性能評(píng)價(jià)或?qū)S家所提供的技術(shù)性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證[14]。美國(guó)病理家學(xué)會(huì)(CAP)要求申請(qǐng)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展新檢測(cè)項(xiàng)目前，需要根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室條件對(duì)廠家提供的性能參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證方可使用[15]，為此CLSI出臺(tái)了一系列EP指南文件，本研究根據(jù)相應(yīng)的EP文件進(jìn)行評(píng)價(jià)，EP5-A2為定量測(cè)量方法的精密度性能評(píng)價(jià)方案，是目前評(píng)價(jià)測(cè)量方法精密度最全面、最具統(tǒng)計(jì)學(xué)效能的方法；EP7-A2為臨床化學(xué)干擾試驗(yàn)-批準(zhǔn)指南，其干擾篩選方案是目前較為常用的方法；EP6-A2為定量測(cè)量方法的線性評(píng)價(jià)方案是多項(xiàng)式評(píng)價(jià)方法中具有代表性的方法[16]。方法學(xué)驗(yàn)證最重要的指標(biāo)是準(zhǔn)確度和精密度。本研究通過(guò)回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證準(zhǔn)確度，計(jì)算平均回收率R為105.70%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。本實(shí)驗(yàn)中黃疸和脂血抗干擾能力較強(qiáng)，而溶血狀態(tài)抗干擾能力較弱，建議在臨床報(bào)告結(jié)果中注明標(biāo)本存在的可能干擾因素，提醒臨床注意。精密度是檢測(cè)系統(tǒng)的主要分析性能之一，更是其他性能評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。精密度是體現(xiàn)重復(fù)性的重要性能指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定IGF-1的低、高值混合血清分析內(nèi)精密度CV分別為6.31%和5.65%，分析間精密度CV分別為6.46%和8.09%，均符合標(biāo)準(zhǔn)要求：不大于15%。線性范圍驗(yàn)證的目的是驗(yàn)證該方法的最高檢測(cè)值和高、低檢測(cè)值之間是否呈線性關(guān)系，其評(píng)價(jià)有助于發(fā)現(xiàn)儀器、校準(zhǔn)品、試劑和操作規(guī)程等方面的誤差來(lái)源，本研究通過(guò)系列比例稀釋，檢測(cè)IGF-1水平，驗(yàn)證對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，通過(guò)目測(cè)圖1可看出多項(xiàng)式的擬合曲線近為重合，所有數(shù)據(jù)幾乎均落在一條直線上，初步判斷最佳的擬合形式為直線，且數(shù)據(jù)的精密度較高，證實(shí)在該濃度范圍內(nèi)稀釋的幾個(gè)點(diǎn)為直線方程，結(jié)果表明實(shí)測(cè)濃度與理論濃度之間相關(guān)性良好，R2為0.9929。

綜上所述，通過(guò)對(duì)IGF-1的分析靈敏度、分析精密度、線性范圍、回收率、干擾實(shí)驗(yàn)和參考范圍的評(píng)價(jià)和分析，證實(shí)AutoLumo A2000檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)測(cè)定IGF-1的靈敏度高、精密度好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，性能可滿足臨床檢測(cè)的要求。