二氫楊梅素改善慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激小鼠認(rèn)知與情感障礙*

王 樂(lè) ，李碧蓉，肖志勇 ，趙金龍，于旭東 △

(1. 邵陽(yáng)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000；2. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

負(fù)性社會(huì)經(jīng)歷是引起人類精神疾病的重要原因。隨著生活節(jié)奏的加快，社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)日漸激烈，社會(huì)挫敗等負(fù)性社會(huì)經(jīng)歷越來(lái)越常見(jiàn)，由此引起的抑郁、焦慮和認(rèn)知障礙成為重大挑戰(zhàn)[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明植物提取物在多種疾病中發(fā)揮重要作用[2-3]，二氫楊梅素(dihydromyricetin, DHM)是提取自藤茶類植物的黃酮類化合物發(fā)揮抗炎，抗氧化，抗腫瘤，護(hù)肝，調(diào)節(jié)脂質(zhì)、血糖代謝及保護(hù)心血管和神經(jīng)的作用[4-6]。但二氫楊梅素在認(rèn)知與情感障礙中的作用卻很少有人研究,尤其在社會(huì)挫敗模型中的作用尚無(wú)報(bào)道。

海馬內(nèi)SIRT1信號(hào)在認(rèn)知與情感障礙中具有重要作用，在多種嚙齒類認(rèn)知障礙、抑郁模型中海馬SIRT1降低，并且抗抑郁藥物可上調(diào)其表達(dá)[7-8]。此外，DHM可上調(diào)阿爾茨海默病大鼠SIRT1表達(dá)[9]，但DHM是否上調(diào)慢性社會(huì)挫敗小鼠海馬SIRT1表達(dá)尚無(wú)報(bào)道。本文基于慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激(chronic social defeat stress，CSDS)誘導(dǎo)的認(rèn)知與情感障礙模型探索二氫楊梅素能否上調(diào)SIRT1信號(hào)改善負(fù)性社會(huì)經(jīng)歷所引起的認(rèn)知障礙、焦慮及抑郁行為。

1 材料與方法

1.1 藥物

二氫楊梅素購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司(LOT：S06J6L1)，β-actin抗體 購(gòu)于美國(guó)proteintech，稀釋比為1∶4 000。SIRT1 抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam，稀釋比為1∶1 000。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理

雄性C57BL/6J小鼠(7周)和ICR小鼠(10周)均購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。兩種小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)條件下：溫度24℃，濕度50%，明暗周期12 h；同種小鼠配對(duì)飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。為使小鼠熟悉實(shí)驗(yàn)操作者，實(shí)驗(yàn)者每天撫摸小鼠，每只5 min。所有行為實(shí)驗(yàn)均在白天進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作遵照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NIH的《國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康與管理?xiàng)l例》。

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激組(CSDS)和慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激+DHM組(CSDS+DHM)，社會(huì)挫敗應(yīng)激小鼠在應(yīng)激的后5 d每天下午腹腔注射DHM(分散于2% DMSO中，劑量為20 mg/kg)或2%的DMSO，藥物及溶媒的注射體積為10 ml/kg。每組各14只,其中10只小鼠用來(lái)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,其它4只于應(yīng)激結(jié)束后24 h檢測(cè)海馬內(nèi)蛋白表達(dá)。三組小鼠在應(yīng)激結(jié)束后的第1～2日進(jìn)行新穎物體識(shí)別測(cè)試,應(yīng)激結(jié)束后第3日進(jìn)行Y迷宮測(cè)試。第4日進(jìn)行社會(huì)交互和曠場(chǎng)測(cè)試,第5日進(jìn)行強(qiáng)迫游泳和懸尾測(cè)試。

1.3 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激

慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激基于之前的研究[10]，社會(huì)挫敗在聚乙烯飼養(yǎng)籠中進(jìn)行,飼養(yǎng)籠被透明隔板平均分開，孔徑0.5 cm的小孔密集的分布于隔板上。在應(yīng)激開始前，ICR小鼠在飼養(yǎng)籠的一側(cè)飼養(yǎng)使其產(chǎn)生領(lǐng)地意識(shí)。應(yīng)激開始時(shí)將C57BL/6J入侵鼠放入ICR攻擊鼠的飼養(yǎng)籠中(飼養(yǎng)ICR攻擊鼠的一側(cè))，停留10 min后, 將C57BL/6J小鼠放入飼養(yǎng)籠隔板的另一側(cè)約24 h,在此期間C57BL/6J小鼠可看到和嗅到ICR小鼠從而進(jìn)一步產(chǎn)生心理應(yīng)激。此過(guò)程連續(xù)10 d，每天C57BL/6J小鼠需要接觸不同的ICR小鼠。對(duì)照組C57BL/6J小鼠,在相同的飼養(yǎng)籠中配對(duì)飼養(yǎng),每側(cè)放一只小鼠。所有對(duì)照組小鼠每隔24 h更換與其配對(duì)飼養(yǎng)的小鼠，使其與不同的小鼠配對(duì)飼養(yǎng)。

1.4 行為學(xué)測(cè)試

1.4.1 新穎物體識(shí)別測(cè)試(NOR) 新穎物體識(shí)別測(cè)試基于之前的報(bào)道[11]，簡(jiǎn)而言之，小鼠分別放入隔音箱中進(jìn)行習(xí)慣化(10 min)、采樣(10 min)和測(cè)試(5 min)三個(gè)階段，每個(gè)階段相隔24 h，其中習(xí)慣化階段為空隔音箱，采樣階段隔音箱內(nèi)放入兩個(gè)相同物體；測(cè)試階段隔音箱內(nèi)的兩個(gè)物體隨機(jī)替換一個(gè)新的識(shí)別物體。視頻分析采用雙盲法由熟練者進(jìn)行，小鼠的鼻子距物體小于1 cm則視為探索。辨別指數(shù)(DI)=(新物體的探索時(shí)間-舊物體的探索時(shí)間)/(新物體的探索時(shí)間+舊物體的探索時(shí)間)。

1.4.2 兩階段Y型迷宮測(cè)試 Y迷宮由三個(gè)完全相同的臂(40 cm長(zhǎng)×8cm寬×20cm高)組成，各臂夾角 120°，迷宮中央?yún)^(qū)恰好為一等邊三角形(邊長(zhǎng)：8 cm)，三個(gè)臂定義為起始臂、其他臂和新穎臂。Y迷宮放置于昏暗的隔音室內(nèi)，隔音室頂部一數(shù)字?jǐn)z像機(jī)用于記錄動(dòng)物的行為。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段，在第一階段，Y迷宮新穎臂被不透明隔板隔斷，將小鼠放入起始臂，使小鼠自由探索起始臂和其他臂10 min，2 h后，取掉新穎臂的隔板，并將小鼠放入起始臂，使其自由探索三臂5 min。在每只小鼠測(cè)試完成后用75%酒精擦拭迷宮內(nèi)部。熟練者雙盲記錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入各臂的次數(shù)及時(shí)間。

1.4.3 曠場(chǎng)測(cè)試(OFT) 曠場(chǎng)測(cè)試在黑色聚乙烯隔音箱(50 cm×50 cm×60 cm)內(nèi)進(jìn)行，箱底被平均分割成25個(gè)方格，其中，中央16個(gè)格子所組成的區(qū)域被定義為中央?yún)^(qū)域。小鼠穿過(guò)的格子數(shù)反應(yīng)自發(fā)活動(dòng)水平。小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間反應(yīng)小鼠的焦慮樣水平。測(cè)試時(shí)將小鼠依次放入測(cè)試箱內(nèi)自由探索5 min。在每次動(dòng)物放入前用75%酒精擦拭箱內(nèi)清除遺留氣味。攝像頭記錄測(cè)試階段小鼠的行為，熟練者雙盲統(tǒng)計(jì)動(dòng)物穿過(guò)的格子數(shù)及在中央?yún)^(qū)域所停留的時(shí)間。

1.4.4 社會(huì)交互測(cè)試(SI) 社會(huì)交互測(cè)試采用接近回避范式,社會(huì)回避測(cè)試在一個(gè)昏暗的隔音箱中進(jìn)行(40 cm×40 cm×60 cm)，在隔音箱的一側(cè)用鐵絲網(wǎng)圍成直徑為10 cm的半圓，圍繞半圓形鐵絲網(wǎng)一周的5 cm視為交互區(qū)。在第一階段，鐵絲網(wǎng)半圓內(nèi)不放小鼠，C57BL/6J小鼠放入隔音箱中自由探索5 min，在第二階段，ICR小鼠放入半圓形區(qū)域內(nèi)，并且將C57BL/6J小鼠放入隔音箱中觀察5 min內(nèi)C57BL/6J小鼠在交互區(qū)所停留的時(shí)間。

1.4.5 懸尾測(cè)試(TST) 細(xì)繩通過(guò)雙面膠帶與小鼠尾尖固定，并懸于測(cè)試箱箱頂，持續(xù)6 min，熟練者僅分析6 min內(nèi)小鼠后4 min的不動(dòng)時(shí)間。小鼠停止掙扎，放棄逃離視為不動(dòng)。

1.4.6 強(qiáng)迫游泳測(cè)試(FST) 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)裝置為直徑20 cm，高30 cm的透明有機(jī)玻璃圓筒，桶內(nèi)水深15 cm，水溫(23±1)℃，放置于隔音箱(800 Lx)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入桶內(nèi)游泳6 min，每只小鼠測(cè)試結(jié)束后，更換桶內(nèi)的水。通過(guò)位于箱頂?shù)臄z像頭記錄小鼠在測(cè)試階段后4 min的行為表現(xiàn)，熟練者雙盲分析小鼠的不動(dòng)時(shí)間。小鼠四肢保持不動(dòng)呈現(xiàn)漂浮狀態(tài)或?yàn)楸３诸^部露出水面的細(xì)微運(yùn)動(dòng)視為不動(dòng)。

1.5 Western blot 檢測(cè)海馬組織SIRT1蛋白表達(dá)

三組小鼠每組各4只，于應(yīng)激結(jié)束后24 h斷頭取腦剝離海馬，液氮冷凍后備用。 取0.3 g 海馬組織，經(jīng)清洗、裂解、低溫高速離心后，取上清液并用 BCA 蛋白試劑盒測(cè)定樣品蛋白的濃度。電泳分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂牛奶封閉 2 h、加入抗 SIRT1 抗體孵育過(guò)夜，TBST 洗滌 3 次，二抗孵育 2 h，用 TBST充分洗滌后與 ECL發(fā)光底物后顯色。曝光后掃描，用圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DHM改善CSDS誘導(dǎo)小鼠認(rèn)知障礙

在新穎物體識(shí)別測(cè)試中，結(jié)果顯示，各組小鼠采樣階段總探索時(shí)間無(wú)顯著性差異(F(2,27)= 0.488,P>0.05,圖1A)。而在測(cè)試階段各組小鼠辨別指數(shù)DI存在顯著性差異(F(2,27)=8.767,P= 0.001,圖1B)。其中，CSDS組小鼠DI顯著性低于Control組(P<0.01)，而CSDS+ DHM組小鼠DI顯著性高于CSDS組(P<0.01)，這些結(jié)果表明DHM 改善CSDS應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠新穎物體識(shí)別記憶障礙。

在兩階段Y迷宮測(cè)試中，結(jié)果如圖1C所示，在對(duì)照組中，小鼠在各臂停留時(shí)間存在顯著性差異(F(2,27)=10.826,P<0.01,圖1C左)，其中，小鼠在起始臂和其他臂的停留時(shí)間顯著性低于新穎臂(P均<0.01)，表明小鼠可以識(shí)別新穎臂。在CSCD組中，小鼠在各臂停留時(shí)間無(wú)顯著性差異(F(2,27)=0.32,P>0.05, 圖1C中)。而在CSDS+ DHM組，小鼠在各臂停留時(shí)間存在顯著性差異(F(2,27)=19.696,P<0.01, 圖1C右)，其中，小鼠在起始臂和其他臂的停留時(shí)間顯著性低于新穎臂(P均< 0.01)。此外，各組小鼠入臂次數(shù)無(wú)顯著性差異(F(2,27)=0.067,P>0.05,圖1D)。這些結(jié)果表明DHM 改善CSDS應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠空間記憶障礙。

A: The total time spent on exploring both objects is shown for the three groups on the sample phase; B: The discrimination index is shown for the three groups on the test phase; C: The duration of arms visits is shown for the three groups; D: The number of arms visits is shown for the three groups; CSDS: Chronic social defeat stress; DHM: Dihydromyricetin

**Pvscontrol group(vsnovel in Fig.1C);##PvsCSDS group

2.2 DHM改善CSDS誘導(dǎo)小鼠焦慮樣行為

曠場(chǎng)用來(lái)測(cè)試小鼠的廣泛性焦慮。結(jié)果顯示，在曠場(chǎng)測(cè)試中各組小鼠中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間存在顯著性差異(F(2,27)=4.24,P<0.05，圖2A)。其中，CSDS 組小鼠中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間顯著性低于Control組(P<0.05)，而CSDS+ DHM組小鼠中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間顯著性高于CSDS組(P<0.05)。此外,各組小鼠穿越的格子數(shù)無(wú)顯著性差異(F(2,27)=0.134,P>0.05，圖2B)。

社會(huì)交互測(cè)試用來(lái)測(cè)量小鼠社交焦慮，在社會(huì)交互測(cè)試中各組小鼠在第一階段交互時(shí)間無(wú)顯著性差異(F(2,27)=0.519,P>0.05，圖2C)。而在第二階段各組小鼠交互時(shí)間存在顯著性差異(F(2,27)=6.199,P<0.01，圖2D)。其中，CSDS組小鼠交互時(shí)間顯著性低于Control組(P<0.01)，而CSDS+ DHM組小鼠交互時(shí)間顯著性高于CSDS組(P<0.05)，這些結(jié)果表明DHM 改善CSDS誘導(dǎo)小鼠焦慮樣行為。

2.3 DHM改善CSDS誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為

強(qiáng)迫游泳測(cè)試、懸尾測(cè)試被用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的抑郁樣水平。結(jié)果顯示，在強(qiáng)迫游泳測(cè)試中各組小鼠不動(dòng)時(shí)間存在顯著性差異(F(2,27)=5.764,P< 0.01，圖3A)。其中，CSDS組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著性高于Control組(P<0.05)，而CSDS+ DHM組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著性低于CSDS組(P<0.01)。在懸尾測(cè)試中各組小鼠不動(dòng)時(shí)間存在顯著性差異(F(2,27)=7.214,P<0.01，圖3B)。其中，CSDS組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著性高于Control組(P<0.05)，而CSDS+ DHM組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著性低于CSDS組(P< 0.01)。此外，如上所述，DHM不影響小鼠自發(fā)活動(dòng)水平，這些結(jié)果表明DHM 改善CSDS誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為。

A: The center time is shown for the three groups in OFT; B: The number of crossing is shown for the three groups in OFT; C: The time in interaction zone is shown for the three groups in SI without target; D: The time in interaction zone is shown for the three groups in SI with target; CSDS: Chronic social defeat stress; DHM: Dihydromyricetin

*P**Pvscontrol group;#PvsCSDS group

A: The immobility time is shown for the three groups in FST; B: The immobility time is shown for the three groups in TST; CSDS: Chronic social defeat stress; DHM: Dihydromyricetin

*Pvscontrol group;##PvsCSDS group

2.4 DHM逆轉(zhuǎn)CSDS誘導(dǎo)小鼠SIRT1蛋白表達(dá)降低

Western blot法檢測(cè)小鼠海馬內(nèi)SIRT1的表達(dá)，結(jié)果顯示，各組小鼠SIRT1蛋白表達(dá)存在顯著性差異(F(2,9)=18.977,P﹤0.01，圖4)。與Control組相比，CSDS組小鼠海馬內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而CSDS+ DHM組小鼠海馬內(nèi)SIRT1蛋白顯著性高于CSDS組(P<0.01)。這些結(jié)果表明，二氫楊梅素改善CSDS誘導(dǎo)小鼠Sirt1蛋白表達(dá)降低。

CSDS: Chronic social defeat stress; DHM: Dihydromyricetin

*Pvscontrol group;##PvsCSDS group

3 討論

負(fù)性社會(huì)經(jīng)歷可增加個(gè)體焦慮、抑郁、精神分裂風(fēng)險(xiǎn)及暴力、反社會(huì)行為。慢性社會(huì)挫敗是一種社會(huì)從屬應(yīng)激。 與人類一樣，在嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)中，慢性社會(huì)挫敗可導(dǎo)致社會(huì)回避、快感缺失、絕望行為、焦慮行為和認(rèn)知障礙[12]。與之前研究一致，當(dāng)前研究顯示，慢性社會(huì)挫敗導(dǎo)致小鼠新穎物體識(shí)別測(cè)試和兩階段Y迷宮測(cè)試中記憶分?jǐn)?shù)和辨別指數(shù)的降低，社會(huì)交互測(cè)試中的社會(huì)回避和曠場(chǎng)測(cè)試中的進(jìn)入中央?yún)^(qū)域時(shí)間降低以及強(qiáng)迫游泳測(cè)試和懸尾測(cè)試中不動(dòng)時(shí)間增加。這些結(jié)果表明社會(huì)挫敗應(yīng)激誘導(dǎo)認(rèn)知障礙、焦慮樣行為、抑郁樣行為。

DHM慢性給藥可改善低壓低氧誘導(dǎo)大鼠水迷宮中認(rèn)知功能損傷[13]以及AD模型小鼠新穎物體認(rèn)知與新穎程序認(rèn)知[14]。最近研究表明，DHM可改善重復(fù)束縛應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠NOR及Y迷宮記憶損傷[15]，當(dāng)前研究應(yīng)用慢性社會(huì)挫敗模型進(jìn)一步表明DHM慢性給藥可改善社會(huì)挫敗誘導(dǎo)小鼠新穎物體識(shí)別測(cè)試和兩階段Y迷宮測(cè)試中記憶分?jǐn)?shù)和辨別指數(shù)的降低。之前研究表明，DHM不影響小鼠和大鼠的自發(fā)活動(dòng)水平和新穎物體測(cè)試中兩物體的總探索時(shí)間[15]。與之前研究一致，當(dāng)前研究表明DHM慢性給藥不影響新穎物體識(shí)別測(cè)試中小鼠穿越格子數(shù)、Y迷宮測(cè)試中的總?cè)氡诖螖?shù)及NOR中采樣階段及測(cè)試階段小鼠對(duì)兩個(gè)物體的總探索時(shí)間。因此，DHM促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶并非通過(guò)影響自發(fā)活動(dòng)性和自發(fā)探索行為。

DHM可改善嚙齒類情感障礙，如DHM逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為及慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激小鼠行為絕望和快感缺失[16]。與之前的研究一致，同時(shí)，慢性注射DHM顯著性降低CSDS應(yīng)激小鼠強(qiáng)迫游泳測(cè)試和懸尾測(cè)試中的不動(dòng)時(shí)間。并且DHM不影響曠場(chǎng)測(cè)試中小鼠活動(dòng)水平。這些結(jié)果表明DHM可改善CSCD應(yīng)激小鼠抑郁樣行為。 由于抑郁和焦慮的共病性[10]，我們進(jìn)一步檢測(cè)了DHM對(duì)CSDS小鼠社交焦慮及廣泛性焦慮的作用。慢性注射DHM顯著性減輕CSDS應(yīng)激小鼠社會(huì)交互測(cè)試中的社交焦慮和曠場(chǎng)測(cè)試中的廣泛性焦慮。

沉默信息調(diào)節(jié)因子 1(silent information regulator1，SIRT1) 是哺乳動(dòng)物去乙?；?Sirtuin 蛋白家族成員，廣泛參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[17]，最近研究表明，SIRT1在抑郁、焦慮、認(rèn)知障礙中具有重要作用。在慢性應(yīng)激抑郁模型，嚙齒類海馬內(nèi)SIRT1基因及蛋白表達(dá)顯著降低[8]。與之前結(jié)果一致，當(dāng)前研究表明，CSDS應(yīng)激小鼠海馬內(nèi)SIRT1蛋白水平降低。丙米嗪、白藜蘆醇等藥物發(fā)揮抗抑郁作用并且上調(diào)SIRT1表達(dá)[18]。與此一致，當(dāng)前結(jié)果DHM顯著上調(diào)SIRT1表達(dá)。考慮到DHM可上調(diào)BDNF表達(dá)以及SIRT1可調(diào)節(jié)BDNF表達(dá),提示SIRT1可能是DHM上調(diào)BDNF的關(guān)鍵信號(hào)。

綜上，本研究基于社會(huì)挫敗模型發(fā)現(xiàn)DHM可改善社會(huì)挫敗應(yīng)激誘導(dǎo)認(rèn)知障礙、抑郁樣行為、焦慮樣行為，并且初步表明及機(jī)制可能與上調(diào)其海馬組織SIRT1的表達(dá)有關(guān)。