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    芹菜多糖抑制小鼠肺癌的作用研究*

    2019-04-15 05:27:44蔣盼若樓恩哲趙智祥徐炯楠鄭曉菲柯瑞君陳佳玉
    中國應用生理學雜志 2019年6期
    關鍵詞:芹菜外周血淋巴細胞

    蔣盼若, 樓恩哲,趙智祥,徐炯楠,鄭曉菲,柯瑞君,陳佳玉

    (紹興文理學院醫(yī)學院,浙江 紹興 312000)

    肺癌是世界范圍內的一大健康問題。據(jù)統(tǒng)計,2014年肺癌占所有惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率首位,在男性惡性腫瘤中分別占比24.63%和29.49%。手術、放療和化療是肺癌治療的常用策略。然而,肺癌患者總是在晚期才被確診,肺癌的5年生存率為16%,其中小細胞肺癌的5年生存率僅為6%。因此,尋找一種能有效治療肺癌的藥物是非常必要和迫切的。

    近年來,人們越來越認識到草本植物和植物來源的藥物具有很強的抗腫瘤潛力[1,2],如紫杉醇、伊立替康和依托泊苷均提取自美國食品和藥物管理局批準用于腫瘤治療的植物藥[3]。芹菜是食藥兩用植物中的一種,已被證明具有許多生物學和藥理學功能,如抗炎、抗氧化和抗微生物等[4]。目前已從芹菜中提取多種成分,其中芹菜素、木犀草素、金圣草黃素、香豆素以及多種聚乙炔和酞類化合物已被證明具有腫瘤抑制作用[5]。芹菜素是芹菜的主要成分,能夠抑制乳腺癌、皮膚癌、前列腺癌、消化道腫瘤和某些血液惡性腫瘤的生長[6]。芹菜中的聚乙炔對急性淋巴細胞白血病有抗增殖活性和抑制生長的作用[7]。芹菜薄壁細胞的初生壁主要由果膠多糖組成[8],該芹菜多糖(polysaccharides from celery, PSC)在芹菜中占有很大的比重,但芹菜多糖對腫瘤,尤其是肺癌的作用及相關機制一直未引起關注。本研究探討了芹菜多糖是否為芹菜的生物活性成分,可否參與抑制肺癌細胞生長,并探索其潛在的分子機制,以期為肺癌治療新藥的發(fā)現(xiàn)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    4~5周齡C57BL/6 小鼠購于浙江省實驗動物中心;各PCR引物的合成由上海Sangon Biotech公司完成;AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒為美國BD公司產(chǎn)品;TRIzol和SuperScript? III First-Strand Synthesis System來自美國Invitrogen公司;TOSOH BIOS TSK - Gel G4000 SWXL柱(7.8×300 mm)源自日本TOSOH BIOS公司;Waters Alliance 2410 RI檢測器為美國Waters公司產(chǎn)品;標準葡聚糖于美國Sigma公司采購。

    1.2 多糖的制備

    粗多糖的分離和純化遵循先前文獻中描述的方法[9]。簡而言之,從超市購買新鮮芹菜,在80℃下用乙醇提取三次,提取時間為3 h,殘渣在100℃下用水煎煮三次,提取時間為3 h(固液比,1∶40 g /ml),3 000×g條件下離心10 min后,水提取物在60℃真空濃縮,用三倍體積乙醇處理,4℃冰箱中沉淀過夜。將沉淀物重新懸浮在水中,并用蒸餾水透析(滲透極限分子量為3.5 kD),不可透析部分在-20℃冷凍,解凍后再次離心以除去不溶性物質。重復凍融10次后,將上清液凍干,收獲粗多糖部分。將粗多糖(6%)溶于蒸餾水中,并將其裝載到DEAE - Sephadex A - 25柱( 90 cm×5 cm )上。用蒸餾水、0.3 mmol/L和0.5 mmol/L NaCl連續(xù)洗脫該柱,每次直至苯酚-硫酸法洗脫碳水化合物陽性反應消失。收集 0.5 mmol/L NaCl洗脫部分,透析并凍干。將含有碳水化合物的餾分合并、透析、凍干,并進一步應用于Sephadex G - 100柱(100 cm×3.5 cm)上,以獲得純化的多糖;濃縮目標餾分,再次透析并凍干。

    用配有TOSOH BIOS TSK - Gel G4000 SWXL柱的Waters 515凝膠滲透色譜法測定芹菜多糖的分子量。該柱用0.1 mmol/L硝酸洗脫,并用標準葡聚糖校準,洗脫由Waters Alliance 2410 RI檢測器監(jiān)控。以D -葡萄糖為標準,用苯酚-硫酸法定量碳水化合物;以牛血清白蛋白為標準,用Bradford法測定蛋白質含量。按照上述方法對每個樣品分析三次。脂多糖(LPS)污染通過鱟阿米巴細胞溶胞產(chǎn)物(limulus amebocytes lysate, LAL)試驗進行檢測。

    1.3 肺癌腫瘤模型制備及用藥

    取4~5周齡C57BL/6小鼠,每只小鼠腹股溝皮下注射2×107個Lewis肺癌細胞并隨機分成5組,每組10只。兩天后,分別灌胃0 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg和100 mg/kg芹菜多糖(藥物體積均為500 μl),共用藥10 d。取腫瘤組織拍照并稱重。

    1.4 小鼠免疫反應的檢測

    荷瘤小鼠給藥10 d后,取從眼球靜脈采集小鼠血液,用小鼠淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法分離小鼠外周血單個核細胞。經(jīng)FITC-CD4+和PE-CD8+抗體染色后,用流式細胞儀分析小鼠外周血中CD4+和CD8+細胞的百分比。取鼠脾,置于滴加生理鹽水的無菌紗布上,用注射器柄研磨脾,獲取單個脾淋巴細胞。1 000 r/min離心5 min回收單個脾細胞,加入5 ml紅細胞裂解液,混勻后于冰上裂解5 min,1 000 r/min離心5 min以回收脾淋巴細胞,并經(jīng)5 ml生理鹽水清洗2次。1 000 r/min離心5 min回收細胞,利用Trizol提取淋巴細胞RNA。所提取的RNA經(jīng)Nano drop 2000定量后,采用SuperScript? III First-Strand Synthesis System逆轉錄成cDNA。以β-actin作為內參,qPCR法分析IL - 2、IFN -γ和IL - 4 mRNA的水平。

    1.5 統(tǒng)計學處理

    2 結果

    2.1 芹菜多糖的特性

    紅外光譜和凝膠滲透色譜法的結果證實本實驗組所提取的芹菜多糖的純度為82%,同時凝膠滲透色譜結果中出現(xiàn)兩個峰,表明芹菜多糖是一種不均一的多糖,該多糖的分子量為1.17×103kD。

    2.2 芹菜多糖抑制肺癌的作用

    將芹菜多糖以0、25、50、75、100 mg/kg的濃度灌胃荷Lewis瘤C57BL/6小鼠。結果顯示,與0劑量組相比,芹菜多糖以劑量依賴的方式抑制Lewis肺癌的生長(圖1),表明芹菜多糖具有很強的抗肺癌作用。

    Fig. 1 PSC inhibited lung cancer growthinvivo(n=10)

    1: PBS treated group; 2-5: 25 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg, 100 mg/kg of PSC treated group

    2.3 芹菜多糖增強了小鼠的免疫反應

    有研究顯示,植物多糖在調節(jié)免疫系統(tǒng)方面具有很強的活性[10]。為了研究芹菜多糖是否能調節(jié)小鼠的免疫反應,我們分析了經(jīng)芹菜多糖(0 mg/kg或75 mg/kg)治療10 d后的小鼠外周血中CD4+和CD8+細胞的百分比。結果證實,小鼠外周血中CD4+和CD8+細胞經(jīng)芹菜多糖治療后都顯著增加,即芹菜多糖治療組小鼠的免疫應答顯著增強(圖2)。此外,qPCR檢測結果顯示,25~100 mg/kg芹菜多糖治療組小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子IL - 2、IFN -γ和IL - 4的mRNA表達上調,且IL - 2、IFN -γ和IL - 4表達水平與用藥劑量有關,其中IL - 2和IFN -γ的升高水平明顯高于IL - 4,結果見圖2、表1。所有這些數(shù)據(jù)表明芹菜多糖可以增強免疫反應,尤其是細胞免疫,這可能有助于其發(fā)揮抗肺癌的功能。

    Fig. 2 PSC up-regulated CD4+and CD8+cells in peripheral blood of mice(n=10)

    *P**PvsPBS treated group

    GroupIL-2/β-actinIFN-γ/β-actinIL-4/β-actinPBS0.44±0.030.56±0.020.65±0.0525 mg/kg PSC0.84±0.011.73±0.07??0.82±0.0450 mg/kg PSC1.28±0.05??2.62±0.10??1.05±0.09??75 mg/kg PSC1.90±0.09??3.05±0.14??1.29±0.14??100 mg/kg PSC2.72±0.17??3.43±0.12??1.51±0.11??

    **P<0.01vsPBS treated group

    3 討論

    目前,已有一些植物多糖被證實具有抗腫瘤的活性并被應用于臨床[10]。一些研究表明,藥用植物多糖的抗腫瘤作用主要是由于其免疫調節(jié)活性。一些藥用植物的多糖通過上調免疫細胞,如T淋巴細胞和NK細胞,增強免疫反應[11]。已經(jīng)證明,當歸和火棘多糖可以增加外周血細胞和脾細胞中CD4+細胞的百分比和CD4+/CD8+比率[12, 13]。此外,來自藥用植物的多糖也有助于細胞因子的增加。例如,當歸和火棘多糖能夠增加外周血細胞和脾細胞中IL - 2的產(chǎn)生。諾尼果果汁中的多糖可以刺激TNF -γ、IL - 1和IL - 10的釋放,抑制肺癌生長,并提高肺癌小鼠的存活率[14]。最近,Chen等人報道羊棲菜多糖通過調節(jié)腫瘤免疫反應[15],如上調腹膜巨噬細胞產(chǎn)生IL - 1和TNF -γ,增加脾細胞增殖,在肺癌中具有強大的抗腫瘤活性。

    芹菜是一種家喻戶曉的食藥兩用植物,包括水芹、旱芹、西芹三種,這三種芹菜功能相近,藥用以旱芹為佳,旱芹被稱為“藥芹”。芹菜富含豐富的蛋白質、碳水化合物、胡蘿卜素、B族維生素、鐵、鈣、磷、鐵、鈉、磷等,同時,有平肝清熱,涼血止血,祛風利濕,除煩消腫,涼血止血,解毒宣肺,祛風利濕,健胃利血、清腸利便、潤肺止咳、降低血壓、健腦鎮(zhèn)靜的功效,至今未發(fā)現(xiàn)芹菜有毒副作用。芹菜中含有多糖成份,但該多糖是否具有防治肺癌的作用及其潛在作用機制尚未見報道。本研究提取和純化了芹菜多糖,并探討了該多糖對肺癌發(fā)生發(fā)展的作用和相關機制。研究結果表明,芹菜多糖可通過上調小鼠外周血中CD4+和CD8+細胞的百分比以及脾淋巴細胞中細胞因子IL - 2、IFN -γ和IL - 4水平來提高小鼠的免疫水平,尤其是細胞免疫水平,從而對肺癌Lewis細胞在小鼠體內的增殖進行抑制。

    芹菜培養(yǎng)條件要求不高,價格便宜。芹菜多糖成份在芹菜中占比較高,易提取和保存,能被患者所接受。因此,芹菜多糖抗肺癌生物功能及相關機制的發(fā)現(xiàn),必將為其進一步抗肺癌的臨床應用打下堅實的基礎。

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