杜仲葉黃酮的提取方法 及其生物活性研究進(jìn)展

(陜西學(xué)前師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,陜西西安 710100)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木,為我國特有的珍貴二類保護(hù)物種[1],種植范圍廣泛,主要分布在湖南、廣西、貴州、四川、陜西等地[2],具有清肝明目、壯陽補(bǔ)腎、調(diào)整血壓、抗疲勞、提高免疫力、延緩衰老等功效,作為一種中藥上品在中國已有2000多年歷史[3-4]。然而,目前對杜仲的開發(fā)利用并不全面,多只局限于杜仲皮和杜仲膠,其中,杜仲皮從古至今一直在中醫(yī)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用,杜仲膠也因其具有優(yōu)異的橡塑二重性,作為一種天然橡膠被廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)領(lǐng)域[5-7],在國內(nèi)外擁有極大的產(chǎn)業(yè)覆蓋面[8-9],而相比于這兩者,資源更為豐富的杜仲樹葉卻一直缺乏有效的加工利用。研究表明,杜仲葉與皮有相似的化學(xué)成分和藥理作用[10-11],但在杜仲不同部位中的總黃酮含量有很大差別,以杜仲葉(尤其是老葉)中的總黃酮含量最高,若對其進(jìn)行提取利用,不僅可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)藥源的不足[12-14],還可以把天然的杜仲葉黃酮應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域,尤其是食品加工領(lǐng)域。利用杜仲葉及其黃酮提取物多種突出的生物活性,將其作為一種良好的保健品原料和添加劑,開發(fā)出營養(yǎng)與保健價(jià)值較高的功能性產(chǎn)品,這對食品行業(yè)的發(fā)展將起到積極的推動(dòng)作用。本文對目前國內(nèi)杜仲葉黃酮的提取方法以及近年來杜仲葉黃酮生物活性和機(jī)理所做的相關(guān)研究進(jìn)行綜述,以期為杜仲葉資源的深度綜合開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 杜仲葉黃酮的提取方法

目前,黃酮類的提取方法主要有水提法、溶劑法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界CO2萃取法、酶解法和半仿生提取法。

1.1 水提法

水提法是將杜仲葉粉碎后,按一定的料液比浸入水中,在適宜的溫度下浸提一定時(shí)間,從而得到含有杜仲葉有效成分浸提液的一種方法。何德飛[15]發(fā)現(xiàn),水提法所選用的料液比和提取時(shí)間對杜仲葉中的有效成分提取有顯著影響,當(dāng)料液比為1∶16、提取時(shí)間24 h時(shí),杜仲葉中的有效成分含量最高。董興葉等[16]以杜仲葉為原料,采用亞臨界水萃取杜仲葉黃酮類化合物,通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定最優(yōu)工藝條件,結(jié)果表明,亞臨界水萃取的最優(yōu)條件為:提取溫度120 ℃、提取時(shí)間30 min、料水比1∶25 (g/mL)、壓力1.0 MPa,此條件下黃酮類化合物得率可達(dá)3.09%±0.06%。亞臨界水萃取法是在一定的壓力下,將水加熱到100～374 ℃(水仍然保持液體狀態(tài))對黃酮進(jìn)行提取,該方法相較于傳統(tǒng)水提法,能夠大幅度縮短提取時(shí)間,并提高黃酮類化合物的得率,更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

1.2 溶劑法

杜仲葉黃酮不但易溶于水,還易溶于乙醇、甲醇、乙醚等有機(jī)溶劑。董娟娥等[17]對提高杜仲葉中主要活性物質(zhì)的提取率進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物的最佳提取條件為:以60%乙醇-水混合溶劑在80 ℃下提取3次,每次30 min。葉文峰等[18]通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)探討了乙醇為溶劑提取杜仲葉總黃酮的最佳提取工藝條件,發(fā)現(xiàn)用70%乙醇、料液比為1∶10條件下提取3次,每次回流1.5 h,杜仲葉總黃酮的提取效果最好,回收率可達(dá)103.1%。趙文紅等[19]分別探究了乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間等因素在杜仲葉總黃酮提取中的影響趨勢,并以正交實(shí)驗(yàn)確定了以12倍量的50%乙醇,在80 ℃條件下回流提取60 min為最佳提取條件,總黃酮得率達(dá)3.08%,占固體提取物的31.9%。劉軍海等[20]以丙酮-水為溶劑對杜仲葉黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,提取溫度65 ℃、丙酮濃度50%、料液比1∶16、提取時(shí)間2 h、浸提2次時(shí),總黃酮提取物得率為17.01%,黃酮含量10.96%。綜合這些研究結(jié)果可以看出,用溶劑法提取杜仲葉黃酮對于提取溫度要求較低,提取時(shí)間較短,但由于要大量使用有機(jī)溶劑,因此該方法更適合小規(guī)模提取。

1.3 超聲提取法

超聲提取法是在溶劑提取的基礎(chǔ)上,利用超聲作用使原料的細(xì)胞壁加速破裂,有效成分更快溶解進(jìn)入溶劑的方法。郭孝武[21]探討了超聲提取杜仲葉黃酮的最佳工藝,發(fā)現(xiàn)采用體積比為40%、料液比1∶60的乙醇水溶液浸泡24 h,再用超聲提取45 min,杜仲葉中總黃酮類物質(zhì)的提出率可達(dá)25.43%。路博瓊等[22]發(fā)現(xiàn),在50%乙醇作為溶劑時(shí),料液比1∶10 (g/mL),60 ℃下超聲提取50 min,杜仲葉黃酮提取物含量較高。羅飛華等[23]通過單因素和正交試驗(yàn)得出了杜仲葉總黃酮的最佳提取工藝條件為:料液比1∶14 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲時(shí)間20 min。許先猛等[24]發(fā)現(xiàn),超聲功率600 W、時(shí)間30 min、乙醇濃度60%、料液比1∶15(g/mL)的條件下黃酮得率最高能達(dá)到2.04%。陶亮亮等[25]發(fā)現(xiàn),提取杜仲葉黃酮的最佳工藝條件是乙醇濃度65%、料液比為1∶25、超聲時(shí)間和溫度分別為35 min和65 ℃,黃酮含量可達(dá)2.28%。超聲輔助提取法對提取液不斷的振蕩對于有效成分的擴(kuò)散和溶出有極大的促進(jìn)作用,能大幅縮短單純用溶劑提取的時(shí)間,降低提取溫度,提高黃酮的提取率,具有節(jié)能、省時(shí)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。但是由于超聲波在傳播過程中會(huì)發(fā)生衰減,作用區(qū)域有限,因而對提取罐的直徑大小有限制,對于振子和罐體的配合度要求也較高,因此目前在工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中,該方法還存在一定的局限性。

1.4 微波提取法

微波提取法是利用微波的能量加快原料分子的熱運(yùn)動(dòng),從而加速破壞細(xì)胞壁使有效成分更快提取出來的方法。目前,微波提取法在植物黃酮類物質(zhì)的提取領(lǐng)域有比較廣泛的應(yīng)用。呂強(qiáng)等[26]對杜仲葉用不同方式進(jìn)行干燥處理后提取,結(jié)果表明,經(jīng)微波處理后的葉片中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.005%,是曬干處理的1.52倍,并且微波殺青后50 ℃烘干處理杜仲葉能夠有效減少活性成分的損失。李旭等[27]用響應(yīng)面曲線法對杜仲葉黃酮的微波提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在杜仲葉粉碎顆粒度100目,料液比1∶60 (mL/g),乙醇濃度67%(v/v),微波功率757 W下提取5.3 min,黃酮的得率最高。劉桂萍等[28]發(fā)現(xiàn),微波輔助水提取杜仲葉總黃酮的最佳工藝條件為料液比1∶25 (g/mL),微波功率320 W,提取時(shí)間2.5 min,總黃酮提取率可達(dá)8.7%。該方法作為一種新型提取工藝,其最大的特點(diǎn)就是能選擇性的促使極性分子加速溶出,控制方便、升溫速度快,能大幅縮短提取時(shí)間,在杜仲葉黃酮工業(yè)化提取中有明顯優(yōu)勢,生產(chǎn)線組成簡單,溶劑選擇方面要求較低,具有無污染、低投資的優(yōu)點(diǎn),然而該方法對于一些非極性物質(zhì)的提取效果并不理想。

1.5 超臨界CO2萃取法

雖然溶劑提取法提取杜仲葉黃酮的得率較高,被廣泛應(yīng)用,但其存在回收溶劑、對提取溫度要求較高等缺陷,相比而言,超臨界CO2萃取法以高于臨界壓力和溫度狀態(tài)下的溶劑,對有效成分進(jìn)行提取,使細(xì)胞壁破碎后釋放溶解出更多的有效成分,具有提取效率高、溫度要求低、溶劑無殘留并能循環(huán)利用的優(yōu)點(diǎn)[29]。李加興等[30]采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對杜仲葉黃酮類化合物的最佳萃取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,添加濃度為80%(v/v)的乙醇水溶液3.5 mL/g 作夾帶劑時(shí),最佳萃取條件為:萃取溫度40 ℃、萃取壓力25 MPa、萃取時(shí)間2.5 h、CO2流速200 kg/h,然后將萃取物加1∶3 (v∶v)的乙醚分離出黃酮類化合物,得率可達(dá)2.032%(w/w)。李秋紅等[31]確定了超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮的最佳工藝條件為:溫度為45 ℃、時(shí)間為2.5 h、壓力為30 MPa、夾帶劑用量為3.5 mL/g,該條件下黃酮提取率為73.26%,產(chǎn)品純度為19.82%。王華芳等[32-33]發(fā)現(xiàn),提取工藝條件為溫度50 ℃,壓強(qiáng)30 MPa,時(shí)間120 min時(shí),杜仲葉黃酮的提取率可達(dá)10.55%,此外,采用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)一步對杜仲葉黃酮的提取工藝進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)溫度51 ℃,壓強(qiáng)31.15 MPa,時(shí)間90 min,所得總黃酮的含量為45.82 mg/g。綜上可知,超臨界CO2萃取法在低溫條件下進(jìn)行,能夠有效防止沸點(diǎn)低、易揮發(fā)的物質(zhì)在提取過程中的損失,不但操作條件溫和,而且提取率較高。由于CO2性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、對環(huán)境無污染,因此超臨界CO2萃取法非常適合用于食品行業(yè)大規(guī)模有效成分的提取和純化,在工業(yè)化生產(chǎn)中萃取壓力、溫度、萃取顆粒大小、CO2流量、夾帶劑的合理選擇問題,都是決定提取效果的關(guān)鍵因素。

1.6 酶解法

酶解法提取是一種使用適合的酶處理原材料,使組成細(xì)胞的纖維素、半纖維素、果膠等物質(zhì)結(jié)構(gòu)破除,便于后續(xù)提取中有效成分在更短時(shí)間內(nèi)溶出的方法[34]。羅季陽等[35]通過試驗(yàn)確定了纖維素酶是提取杜仲葉活性成分的一種有效酶,在pH4.5,溫度55 ℃,加酶量0.01%的條件下提取2.5 h時(shí),杜仲葉活性成分的提取率較高。酶解法提取具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn),提取效率高,節(jié)約能耗的同時(shí),能夠使有效成分快速溶解,在成分復(fù)雜的中藥材提取方面具有重大的應(yīng)用意義[36]。

1.7 半仿生提取法

半仿生提取法是將原料提取液制成藥物制劑,在選定的pH下,模擬藥物在胃腸道內(nèi)的消化轉(zhuǎn)運(yùn)吸收過程,根據(jù)生物藥劑學(xué)角度而設(shè)計(jì)出的提取工藝[37]。陳曉娟等[38]以杜仲葉為原料,以磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖溶液作為提取液,用果膠酶酶解2 h后,升溫回流提取,黃酮得率達(dá)0.043%。鄧佑林等[39]研究了半仿生法及超聲輔助半仿生法提取杜仲葉黃酮的條件,結(jié)果表明,半仿生法在提取時(shí)間1.5 h,提取溫度60 ℃,料液比1∶20 (g/mL)時(shí),黃酮提取率高達(dá)325.0 mg/g;超聲波輔助法提取的最佳條件為時(shí)間50 min,溫度65 ℃,料液比1∶40 (g/mL),黃酮提取率為264.4 mg/g。超聲波輔助提取能使提取時(shí)間大為縮短,但黃酮的提取率卻比半仿生法低。半仿生提取法的特點(diǎn)是提取過程符合口服藥物在胃腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn),最大限度地將有效成分提取出來并且活性損失較少,尤其是結(jié)合酶的作用,不僅能使混合物充分發(fā)揮其綜合作用,又能利用單體成分控制質(zhì)量,因此,該方法在中藥的有效成分提取和配方研究中有良好優(yōu)勢和廣泛的應(yīng)用前景[40],只是目前在該領(lǐng)域中,半仿生提取法仍沿襲傳統(tǒng)的高溫煎煮方式,容易破壞藥效,有效成分損失較多。

2 杜仲葉黃酮的生物活性

2.1 抗氧化活性

抗氧化是黃酮類化合物的一大特性,關(guān)于杜仲葉黃酮是否具有較強(qiáng)的抗氧化活性,有學(xué)者進(jìn)行了以下的研究。李旭等[41]利用微波輔助提取工藝從杜仲葉中提取出總黃酮,探究其對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除作用,發(fā)現(xiàn)清除自由基能力明顯高于VC,表明杜仲葉黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。羅飛華等[42]研究發(fā)現(xiàn),杜仲葉黃酮提取物具有較好的還原能力,同時(shí)對超氧陰離子有較強(qiáng)的清除作用,且隨著黃酮添加量的增大活性增強(qiáng)。此外,賈征等[43-44]對杜仲葉黃酮進(jìn)行提取并測定了體外抗氧化能力,研究表明,杜仲葉黃酮對羥自由基、超氧陰離子均有較強(qiáng)的清除作用,對紅細(xì)胞溶血和脂質(zhì)過氧化有明顯的抑制作用,而且隨著黃酮添加量的增大而增大,是一種天然有效的抗氧化劑。Lin等[45]對其抗氧化活性的分子機(jī)制做了深入研究,發(fā)現(xiàn)對大鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞的存活率和凋亡率有劑量依賴性地提高,使Caspase-3/6/7/9的蛋白表達(dá)量顯著降低。以上研究表明,杜仲葉黃酮抗氧化作用的機(jī)理在于清除自由基,對MDA、SOD和GSH-PX等酶在大鼠體內(nèi)的作用產(chǎn)生影響,減緩脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度,并通過多種細(xì)胞保護(hù)作用發(fā)揮抗氧化活性。

2.2 抗疲勞活性

2.3 降血糖活性

由于杜仲葉的次生代謝產(chǎn)物能夠阻礙和延緩葡萄糖的吸收,因此杜仲葉具有良好的降血糖功效。Xin等[50]用大鼠建立糖尿病模型,發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物能對高血糖大鼠體內(nèi)的胰島素發(fā)揮長效的積極作用。刑冬杰等[51]研究了杜仲葉黃酮對糖尿病大鼠血糖控制及胰島細(xì)胞的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,杜仲葉黃酮處理組能明顯降低糖尿病大鼠胰腺組織中MDA水平、提高SOD及GSH-Px水平,并能降低大鼠的FBG,改善糖耐量,提高FINS水平,胰島面積增加,細(xì)胞數(shù)明顯增多。Lee等[52]發(fā)現(xiàn),杜仲葉提取物降血糖的同時(shí),能增加血漿中胰島素和C肽的表達(dá),使糖尿病大鼠胰腺β細(xì)胞的功能增強(qiáng)。以上結(jié)果表明,杜仲葉黃酮可顯著降低血糖,改善糖耐量,其機(jī)制之一是能增加FINS水平,降低氧化應(yīng)激反應(yīng),對胰島細(xì)胞具有保護(hù)作用。

2.4 降血脂活性

中醫(yī)認(rèn)為,杜仲葉不但能護(hù)肝保腎,還能降低血脂、減少中性脂肪形成,對于發(fā)揮降血脂作用的主要功效成分和相關(guān)分子機(jī)制,相關(guān)學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了研究。劉靜等[53]對杜仲葉黃酮的降血脂作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)杜仲葉黃酮能降低營養(yǎng)性高脂血癥小鼠的血脂,還具有抗氧化作用。雷燕妮等[54]采用微波法提取杜仲葉黃酮,并用其在高血脂動(dòng)物模型上進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)杜仲葉黃酮具有良好的降血脂作用。兩項(xiàng)研究中,杜仲葉總黃酮都能使高血脂大鼠血清中的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量顯著降低,顯著升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量,從而有良好的降血脂活性,Choi等[55]探究了杜仲葉提取物對高血脂癥金黃地鼠的降脂作用及機(jī)制,發(fā)現(xiàn)其能顯著降低TG、TC、LDL-C和游離脂肪酸的含量,反之提高HDL-C的比例和載脂蛋白A-I的水平,血漿中總膽固醇濃度與肝內(nèi)HMG-CoA還原酶緊密相關(guān),杜仲葉總黃酮參與調(diào)控膽固醇代謝通路是其分子機(jī)制之一。

3 杜仲葉應(yīng)用現(xiàn)狀及前景展望

2011年4月,國家發(fā)改委發(fā)布的“產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整目錄”中首次將“杜仲種植生產(chǎn)”列入鼓勵(lì)類目錄中,并啟動(dòng)了杜仲綜合利用示范基地的培育工作。作為陜西省秦巴山區(qū)豐富的優(yōu)勢資源,杜仲也被列入了陜南循環(huán)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2009～2020年)需推廣規(guī)范化種植的藥材藥源中,亟待全面開發(fā)。

目前杜仲皮、杜仲膠的加工技術(shù)已經(jīng)趨于成熟,而大量的杜仲樹葉卻未得到合理開發(fā)利用。長期以來杜仲葉用途單一,主要用來給家禽家畜做功能飼料[56],造成了資源浪費(fèi)。筆者認(rèn)為,對于杜仲葉資源的深度開發(fā),未來有兩個(gè)方向的趨勢。第一,將杜仲葉中的有效活性成分進(jìn)行提取分離后,再把樹葉殘?jiān)龀蓜?dòng)物飼料等進(jìn)行二次利用。以本文綜述的杜仲葉黃酮為例,杜仲葉中黃酮含量高,提取方法多樣,并且具有良好的生物活性,可作為一種很好的天然植物黃酮來源。以此類推,從杜仲葉中可提取利用的還有諸如咖啡酸、綠原酸、桃葉珊瑚甙等多種活性物質(zhì),這樣既發(fā)揮了杜仲葉所含有的這些功能性成分的優(yōu)勢,又對葉子進(jìn)行了充分利用,是未來杜仲葉開發(fā)的一大趨勢。第二,將杜仲葉作為原料研發(fā)成具有保健功能的產(chǎn)品,例如杜仲茶,杜仲固、液體飲料等。在大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展空間日益擴(kuò)大的今天,純天然的植物保健產(chǎn)品將會(huì)面臨無限的機(jī)遇和挑戰(zhàn),對于杜仲這種還不被人們熟知的資源,若能利用其良好的功效性,成功研發(fā)出一款產(chǎn)品,將會(huì)對人類的健康產(chǎn)生莫大的裨益,對大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到一定的推動(dòng)作用,相信這會(huì)是杜仲葉開發(fā)的又一大趨勢。

同時(shí),杜仲葉資源的開發(fā),還將有效促進(jìn)杜仲林的種植與保護(hù),保護(hù)環(huán)境的同時(shí)提高自然資源利用率,有利于當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收致富,帶動(dòng)種植運(yùn)輸?shù)刃袠I(yè)發(fā)展,產(chǎn)生顯著的環(huán)境效益、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。