兩種魔芋多糖抗疲勞及降血糖活性

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(陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021)

魔芋(Konjac)為天南星科多年生草本植物的塊莖,主要產(chǎn)于陜西、四川、云南[1]等地。魔芋加工成精粉后所得的主要成分是魔芋多糖(Konjac glucomannan,KGM)[2]。KGM又稱魔芋葡苷露聚糖,它是一種水溶性的、高分子量的多糖，而將KGM通過酶解法、酸解法、輻照法等方法降解后可得到魔芋低聚糖(Konjac glucomannan oligosaccharide,KOGM)。

研究表明,KGM具有多種獨特的理化性質(zhì),如吸水性、流變性[3]、增稠性[4]和成膜性[5]等。同時,KGM還具有良好的降脂、降血糖、減肥、潤腸通便、抗腫瘤和抗氧化能力[6-7]等生理活性。而KOGM和KGM同樣具有降血脂、減肥等生理活性,此外,KOGM還具有促進益生菌生長、調(diào)節(jié)免疫等功效[2]。

目前,關于魔芋多糖的研究主要集中在其性質(zhì)和生物學方面[3,7],但是鮮見關于KGM及KOGM的抗疲勞及其糖耐量作用的研究報道。因此本實驗通過構(gòu)建小鼠游泳疲勞模型,研究了KGM及KOGM的抗疲勞活性,同時通過口服葡萄糖糖耐量實驗,研究KGM及KOGM對正常小鼠糖耐量的改善作用,為KGM及KOGM作為藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物為SPF級昆明種小鼠 雄性,體重20～22 g,西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心,許可證號:SYXK2012(陜)2012-006;KGM及KOGM 純度≥95.0%,四川西亞化工股份有限公司;鄰苯三酚、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)和其余化學試劑 均為國產(chǎn)分析純。

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;752型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司;7230G可見分光光度計、TDL-40B電子天平 上海精密科學儀器有限公司;TGL-16C高速離心機 上海安亭儀器廠;85-1磁力加熱攪拌器 國華電器有限公司;羅康全活力型血糖試紙、Accu-Chek Aticve血糖儀 Roche Diagnostics Gmbh。

1.2 抗疲勞實驗

1.2.1 力竭游泳實驗 取35只SPF級小鼠,適應性喂養(yǎng)3 d后,隨機分為空白對照組,KGM高劑量組(60 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)、低劑量組(15 mg/kg)及KOGM高劑量組(60 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)、低劑量組(15 mg/kg)共7組,每組5只。空白對照組給予等體積生理鹽水,其余各組按照不同給藥濃度,每天給藥1次,連續(xù)給藥6 d。末次給藥30 min后,稱量小鼠體重,之后將小鼠放入(70 cm×50 cm×40 cm,水深為30 cm,水溫保持在25±0.5 ℃)游泳箱中游泳,每只小鼠尾部附著其體重5%的鉛絲。從小鼠入水開始計時,直至其體力耗盡(判斷標準:小鼠頭部沉入水中5 s內(nèi)不能浮出水面),記錄各組小鼠的力竭游泳時間。力竭游泳后,待各組小鼠恢復1 h,取小鼠肝臟經(jīng)生理鹽水清洗并于-20 ℃冰箱冷凍保存,之后在4 ℃下進行勻漿。

1.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[8]測定組織中SOD含量。取20 μL肝臟組織勻漿,加入3 mL pH8.2的磷酸緩沖液及50 mmol/L鄰苯三酚,搖勻后立即于325 nm下測定反應體系的吸收值,且每隔30 s記錄一次,反應3 min。肝臟樣品SOD的比活力以下式1,2計算。

單位體積活力(U/mL)=[0.07-1/3(At-A0)]/(0.07×0.02)

式(1)

樣品SOD比活力(U/mg·Pro)=單位體積活力/Cpr(U/mg·Pro)

式(2)

式中,At-3 min時樣品溶液的吸光值;A0-0時刻樣品溶液的吸光值;Cpr-樣品蛋白質(zhì)含量(mg/mL)。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量的測定 采用TBA比色法[8]測定肝臟組織中脂質(zhì)過氧化的程度,取0.3 mL肝臟組織勻漿,加入TCA-TBA-HCl溶液1.0 mL,靜置10 min后,沸水浴反應30 min,流水徹底冷卻,再加入5 mL正丁醇萃取反應產(chǎn)物MDA,4000 r/min離心10 min取上清液于532 nm下測量吸收值。

樣品MDA含量(nmol/mg·Pro)=(AMDA×5/ε)/(0.3×Cpr)×106

式(3)

式中,AMDA-樣品溶液的吸光值;ε-脂質(zhì)過氧化物摩爾消光系數(shù)1.56×105(L·cm-1·mol-1);Cpr-樣品蛋白質(zhì)含量(mg/mL)。

1.3 糖耐量試驗

取40只SPF級小鼠,適應性喂養(yǎng)3 d后,隨機分為空白對照組,陽性對照組,KGM高劑量組(60 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)、低劑量組(15 mg/kg)及KOGM高劑量組(60 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)、低劑量組(15 mg/kg)共8組,每組5只,空白對照組灌胃等量生理鹽水,陽性對照組給與鹽酸二甲雙胍(110.5 mg/kg),每日灌胃1次,連續(xù)灌胃6 d,第6 d給藥后禁食不禁水12 h,第7 d各組小鼠灌胃葡萄糖水溶液(150 mg/mL),尾靜脈取血,用血糖儀檢測0、30、60、120 min的血糖水平,進行口服葡萄糖糖耐量實驗[9-10]。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗疲勞實驗結(jié)果

2.1.1 KGM和KOGM對小鼠力竭游泳時間的影響 疲勞是指機體生理功能不能維持在特定的水平,或不能維持預期的運動負荷強度,從而導致工作能力和工作效率下降,屬于一種復雜的生理變化過程[11-13]。力竭游泳測試是最常用的抗疲勞測試方法,而力竭游泳時間則是反映運動耐力最重要的指標,可以最直接地體現(xiàn)出所研究藥物的抗疲勞功效[14-15]。KGM及KOGM對小鼠力竭游泳時間的影響如圖1、圖2所示,與空白對照組相比,KGM和KOGM可以在一定程度上延長小鼠負重游泳時間,其中KGM高劑量組可以極顯著延長小鼠負重游泳時間(p<0.01),KGM中劑量組、低劑量組以及KOGM高劑量組能夠顯著延長小鼠負重游泳時間(p<0.05),說明KGM和KOGM對小鼠具有一定程度的抗疲勞效果。同時,不同劑量的KGM和KOGM對小鼠的抗疲勞效果也有所不同,高劑量具有最佳效果。結(jié)果表明,KGM具有抗疲勞作用。

圖1 KGM組小鼠游泳時間Fig.1 Swimming time of KGM group in mice

圖2 KOGM組小鼠游泳時間Fig.2 Swimming time of KOGM group in mice

2.1.2 KGM和KOGM對運動后小鼠肝臟中SOD活力的影響 機體在運動,特別是大量運動時會使自由基的凈生成量增多[16],自由基具有很強的氧化能力,它可以影響機體的正常生理秩序,使機體的代謝發(fā)生改變,造成機體氧化損傷[17]。SOD是清除體內(nèi)自由基的關鍵酶,可以保護細胞免受損傷[18]。因此檢測機體中的SOD活力高低可以間接地反映出機體保護受損細胞以及清除體內(nèi)自由基的能力[19]。KGM和KOGM對小鼠肝臟中SOD活力的影響見圖3、圖4。與空白對照組相比,KGM和KOGM高劑量組中的SOD活力極顯著增加(p<0.01)、中劑量組中的SOD活力顯著增加(p<0.05),低劑量組與空白對照組相比沒有顯著性差異(p>0.05)。

圖3 KGM對運動后小鼠肝臟中SOD活力的影響Fig.3 Effect of KGM on SOD activity in mice liver after exercise

圖4 KOGM對運動后小鼠肝臟中SOD活力的影響Fig.4 Effect of KOGM on SOD activity in mice liver after exercise

2.1.3 KGM和KOGM對運動后小鼠肝臟中MDA含量的影響 MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,可以改變細胞膜的通透性,引起核酸、蛋白質(zhì)等生命大分子發(fā)生交聯(lián)聚合,能夠反映機體的損傷程度[18,20]。KGM和KOGM對小鼠力竭游泳后肝臟中的MDA含量影響結(jié)果見圖5、圖6,與空白對照組相比,KGM和KOGM高劑量組可顯著降低小鼠細胞中的MDA(p<0.05),從而避免了小鼠劇烈運動后大量MDA的積累對細胞所造成的傷害。雖然KGM和KOGM中劑量和低劑量組也可以降低肝臟中MDA的含量,但與空白對照組相比未顯示出顯著性差異(p>0.05),說明KGM和KOGM對MDA含量的影響可能呈劑量依賴性。實驗結(jié)果表明,與對照組相比,KGM和KOGM具有提高小鼠肝臟中SOD活力、降低MDA含量的作用,說明KGM和KOGM有抗疲勞藥理作用,且以高劑量組的效果最佳,而低劑量并未發(fā)現(xiàn)有明顯優(yōu)勢。

圖5 KGM對運動后小鼠肝臟中MDA含量的影響Fig.5 Effect of KGM on MDA content in mice liver after exercise

圖6 KOGM對運動后小鼠肝臟中MDA含量的影響Fig.6 Effect of KOGM on MDA content in mice liver after exercise

2.2 糖耐量實驗結(jié)果

糖耐量是指人體對葡萄糖的耐受能力[21-22]。而糖耐量降低是二型糖尿病發(fā)展的一個中間階段,糖耐量的恢復程度是評價藥物療效的一個重要方面[10]。在口服葡萄糖糖耐量實驗中,先對小鼠的空腹血糖進行測定,之后立即灌胃葡萄糖,每隔固定時間測定小鼠血糖值。由于葡萄糖的攝入,在30 min時小鼠血糖值較攝入葡萄糖前有較大程度的提高,60 min時由于葡萄糖吸收較為完全,因此較30 min時有所下降。在120 min時較60 min時有較大程度的下降,相當于餐后的血糖值已趨于平穩(wěn),據(jù)此可以測試藥物的糖耐量改善作用。

由表1可知,KGM和KOGM兩種不同分子量的多糖對小鼠糖耐量的改善沒有明顯差異,效果幾乎相同?？瞻捉M、KGM和KOGM各不同劑量組及陽性對照組小鼠血糖值均在30 min時達到峰值,60 min時有所下降,在120 min時恢復到正常血糖值。與空白對照組相比,KGM高劑量組能夠顯著降低給葡萄糖30 min后的小鼠血糖值(p<0.05),但給藥60和120 min后的血糖值,與空白組相比無顯著差別。與空白組相比,KOGM高劑量組能夠降低給葡萄糖30 min后的血糖值(p<0.05)。灌胃葡萄糖30 min后,與陽性對照組相比,KOGM高劑量組具有極顯著性，KGM各劑量組和KOGM、低劑量組具有顯著性差異(p<0.05),在60和120 min時,與陽性對照相比,KGM各劑量組、KOGM高劑量組和中劑量組沒有明顯差異。說明KGM和KOGM在一定程度上能夠降低小鼠血糖值,KGM的降糖效果強于KOGM,兩者比陽性對照藥物二甲雙胍更早發(fā)揮降糖作用。

表1 KGM和KOGM對小鼠葡萄糖耐受量的影響Table 1 Effect of KGM and KOGM on glucose tolerance in mice

在本實驗中,陽性二甲雙胍組在30 min時的血糖值遠高于兩種不同分子量多糖在30 min時的血糖值,這主要是因為二甲雙胍需要一定的時間來增強周圍組織對胰島素的敏感性,促進肌肉等外周胰島素靶組織對葡萄糖的攝取和利用,從而增加葡萄糖的攝取,減少肝糖原的輸出以及糖原異生,從而達到降血糖的目的[23]。而多糖可以增加小鼠的糖原儲存能力,在小鼠的肝糖原水平恢復上起到了主要作用,兩者的作用機制有所不同,因此在30 min時的血糖值會有較大差異。本實驗研究結(jié)果表明,與空白對照組相比,KGM和KOGM兩種分子量的多糖在連續(xù)服用6 d后,均具有增強機體對葡萄糖的耐受能力,尤其以高劑量組和陽性二甲雙胍藥物組效果最為明顯。表明兩種分子量的多糖可以提高機體對葡萄糖的耐受能力,且以高劑量組效果最佳。

3 結(jié)論

綜上所述,KGM和KOGM可以延長小鼠力竭游泳時間,具有一定的抗疲勞作用,其中KGM的效果優(yōu)于KOGM的效果,同時通過測定相關酶學指標,得出KGM和KOGM都可以提高小鼠肝臟中SOD活力,降低MDA含量?？诜咸烟翘悄土繉嶒灡砻?KGM可以改善小鼠糖耐量,具有一定的降血糖效果。但KGM和KOGM兩種不同分子量的多糖降血糖方面并沒有顯示出明顯差異。本研究結(jié)果表明,一定量的KGM和KOGM具有抗疲勞和降血糖效果,可以對糖尿病起到防治作用,同時為魔芋多糖的進一步開發(fā)和研究提供科學依據(jù)。