超聲輔助熱水提取-離子色譜法 同時測定蔬菜中的硫氰酸鹽和高氯酸鹽

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(寧波市食品檢驗檢測研究院,浙江寧波 315048)

硫氰酸鹽又稱硫氰化物,包括硫氰酸鈉、硫氰酸鉀、硫氰酸銨等,屬于高環(huán)境風險產(chǎn)品。人體若過量攝入硫氰酸鹽,其在體內(nèi)會釋放氰根離子,引起人體急性毒性,從而表現(xiàn)出惡心、嘔吐、昏迷、器官功能衰竭等癥狀;硫氰酸鹽的慢性毒性主要是抑制碘的轉(zhuǎn)運和甲狀腺激素合成,引發(fā)甲狀腺疾病,影響胎兒和嬰幼兒大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育[1]。研究表明,許多植物,尤其是十字花科類植物,含有大量的硫代葡萄糖甙(硫甙),硫甙在硫葡萄糖甙酶作用下可降解為硫氰酸鹽[2]。目前,關(guān)于單體硫氰酸鹽對生物體毒性研究較多[3-4],但富含硫氰酸鹽植物對生物體影響的報道較少[5-6],硫氰酸鹽的檢測方法研究集中在乳制品測定中,主要包括分光光度法、電位滴定法、毛細管電泳法和離子色譜法[7-12]等,至于蔬菜中硫氰酸鹽的檢測方法至今還未有任何報道。

高氯酸鹽是指高氯酸形成的鹽類,廣泛存在于自然界中,主要用作火箭燃料和煙火中的氧化劑和安全氣囊中的爆炸物,由于其水溶性、流動性強,具有高度的擴散性和持久性,易導致對水源、土壤等環(huán)境的長期污染,經(jīng)植物吸收富集后,可通過食物鏈進入人體[13-14]。高氯酸鹽是一種持久性的有毒化學物質(zhì),能被甲狀腺吸收,減少甲狀腺對碘的吸收,干擾人體甲狀腺的正常功能,從而影響大腦組織的發(fā)育,對胚胎、嬰幼兒和少年兒童的發(fā)育危害巨大[15]。目前已有關(guān)于水、土壤、乳制品、茶葉等中高氯酸鹽含量的相關(guān)報道[16-25],較少有蔬菜中的相關(guān)研究報道[26]。

目前,我國還沒有蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽檢測的國家標準或行業(yè)標準,也沒有蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的限值規(guī)定以及蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽對人體健康的潛在風險評估(尤其對于存在甲狀腺疾病的人群)。因此發(fā)展一種蔬菜中快速、高效、準確的硫氰酸鹽和高氯酸鹽檢測方法,對我國蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的正常生理濃度作全面普查,并在此基礎(chǔ)上制定不同類蔬菜中合理的限量標準具有重要意義。但是,目前氰酸鹽和高氯酸鹽的測定方法中,樣品前處理方法均較為復雜,前處理時間長,操作繁瑣。如離子色譜法測定乳制品中硫氰酸鹽含量前處理多為溶劑提取+固相萃取(SPE)柱凈化模式,由于乳粉樣品含有大量蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì),影響色譜柱的壽命,因而在提取后必須采用乙腈、乙酸等有機溶劑去除樣品中的蛋白質(zhì),過RP固相萃取柱去除樣品中的脂肪后再進行測定[7-10];離子交換高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉和雞肝中的高氯酸鹽,前處理采用乙酸溶液-乙腈提取,固相萃取柱凈化再進行測定[27]。

本文建立了以超聲輔助超純水提取,離心后直接過膜進樣分析的前處理技術(shù)和超強親水性色譜柱分離、中等濃度氫氧化鉀淋洗液洗脫的特定離子色譜條件下,同時測定蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的方法,以期為我國蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽檢測的國家標準或行業(yè)標準的建立提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蔬菜(西藍花、五號菜、菠菜、青菜、包心菜、大白菜)和蔬菜干制品(萬年青、蘿卜干) 購于寧波市清水橋菜市場;KOH淋洗液 色譜純,美國戴安公司;超純水 實驗室自制;1000 mg/L硫氰酸鹽(SCN)標準品 美國o2si smart solutions公司;1000 mg/L高氯酸鹽(ClO4) 美國Inorganic Ventures公司。

AQUION離子色譜儀 美國戴安公司,配有淋洗液自動發(fā)生裝置、電導檢測器、抑制器;Milli-Q Reference超純水儀 美國MILLIPORE公司;KS300EI超聲波清洗器 寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司;TGL-20M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;ME204E電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;JYL-C16V九陽料理機 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將不同種類的新鮮蔬菜和蔬菜干制品采用九陽料理機精磨粉碎,分別取鮮樣10 g、干樣2 g于50 mL刻度離心管中,加超純水至20 mL,室溫下超聲(功率300 W)提取20 min,然后將獲得的超聲提取液在8000 r/min下離心5 min,上清液過0.22 μm濾膜,上機待測[10,24]。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:IonPac AS16分析柱,IonPac AG16保護柱;抑制器:ASRS-500e型抑制器,4 mm,外加水抑制模式;抑制電流:161 mA;柱溫:30 ℃;淋洗液:KOH溶液,梯度洗脫;淋洗液流速:1.0 mL/min;進樣體積:100 μL;梯度洗脫條件見表1[10,25]。

表1 色譜柱梯度淋洗條件Table 1 The gradient elution conditions in the chromatographic column

1.2.3 標準曲線的繪制與檢出限 將硫氰酸鹽和高氯酸鹽標準品用超純水稀釋,分別配制成0.2、0.5、1、2、5 mg/L和0.04、0.1、0.2、0.4、1 mg/L的混合標準溶液,在1.2.2 色譜條件下,將不同濃度的標準溶液依次進樣分析,測定相應(yīng)的色譜峰面積值,以硫氰酸鹽和高氯酸鹽的質(zhì)量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得到硫氰酸鹽和高氯酸鹽的線性方程及相關(guān)系數(shù),以信噪比S/N=3計算其檢出限。

1.2.4 方法回收率及重復性實驗 取6份包心菜樣品按1.2.1 樣品前處理和1.2.2色譜條件下測定硫氰酸鹽和高氯酸鹽含量,計算其相對標準偏差。

分別向包心菜樣品加入低、中、高3種不同濃度的硫氰酸鹽和高氯酸鹽標準溶液,充分混勻,按1.2.1 樣品前處理和1.2.2色譜條件下進行測定,計算樣品加標回收率。

1.2.5 實際樣品的測定 采用1.2.1 樣品前處理和1.2.2色譜條件下對市售8類蔬菜樣品進行測定,計算其硫氰酸鹽和高氯酸鹽的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 16.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件處理分析試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 淋洗液和色譜柱的選擇

陰離子交換色譜中,淋洗液一般為碳酸根和氫氧根,親脂性季銨烷功能基色譜柱比較適合于碳酸根淋洗液,親水性季銨烷醇功能基色譜柱則比較適合于氫氧根淋洗液,硫氰酸根和高氯酸根離子屬于高價、易極化和疏水性的陰離子,對固定相有較強的親和力,在普通的陰離子色譜柱上保留時間長,色譜峰較寬且拖尾,甚至不被洗脫,因此需要選擇親水性色譜柱。美國戴安公司常用的親水性色譜柱中,IonPac AS16陰離子色譜柱為超強親水性色譜柱,且其固定相上鍵合強親水性烷醇基季銨鹽對氫氧根的親和力較強,使用中等濃度的氫氧根淋洗液即可達到易極化陰離子的快速分離,并且峰型尖銳對稱[28]。因此,選用的淋洗液為KOH溶液,色譜柱為IonPac AS16陰離子色譜柱。

2.2 標準曲線與檢出限

以硫氰酸鹽和高氯酸鹽質(zhì)量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,標準溶液色譜圖如圖1所示,得到硫氰酸鹽在0.2～5.0 mg/L線性范圍內(nèi)的線性方程為Y=1.6637X-0.0876,相關(guān)系數(shù)r=0.9997,高氯酸鹽在0.04～1.00 mg/L線性范圍內(nèi)的線性方程為Y=0.8629X-0.0036,相關(guān)系數(shù)r=0.9989,表明兩種物質(zhì)的峰面積與質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性良好;以信噪比S/N=3計算檢出限,硫氰酸鹽和高氯酸鹽的檢出限分別為0.005、0.008 mg/L。

圖1 硫氰酸鹽和高氯酸鹽標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of thiocyanate and perchlorate standard solution注:峰1：硫氰酸鹽；峰2；高氯酸鹽。

2.3 方法回收率及重復性實驗

樣品中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的離子色譜圖見圖2,計算結(jié)果的相對標準偏差和平均加標回收率分別見表2和表3。由表2和表3可知,硫氰酸鹽和高氯酸鹽相對標準偏差分別為1.6%和6.9%,表明該方法重復性較好;硫氰酸鹽和高氯酸鹽的平均加標回收率分別在89.9%～98.4%之間和81.2%～94.4%之間,表明該方法準確度較高。

圖2 樣品中硫氰酸鹽和高氯酸鹽色譜圖Fig.2 Chromatograms of thiocyanate and perchloratein in the sample注:峰1：硫氰酸鹽；峰2；高氯酸鹽。

表2 包心菜樣品中硫氰酸鹽 和高氯酸鹽含量及精密度(n=6)Table 2 Thiocyanate and perchlorate content and precision(RSD)in the cabbage samples(n=6)

表3 包心菜樣品中硫氰酸鹽 和高氯酸鹽的平均加標回收率(n=6)Table 3 Standard addition recoveries of thiocyanate and perchlorate in the cabbage samples(n=6)

2.4 實際樣品測定

采用本方法對8類蔬菜樣品進行檢測。由表4可知,檢測樣品中均含有一定量的硫氰酸鹽和高氯酸鹽,含量分別在2.869～32.35和0.057～1.417 mg/kg范圍內(nèi),其中蘿卜干含量最高,干制蔬菜的硫氰酸鹽和高氯酸鹽含量明顯高于新鮮蔬菜,這可能是由于新鮮蔬菜含水量較高的緣故。

表4 樣品中硫氰酸鹽和高氯酸鹽含量(n=3)Table 4 Thiocyanate and perchlorate content in the samples(n=3)

由于人體每天對蔬菜的攝入量較大,《中國居民膳食指南》推薦正常成年人每人每天蔬菜攝入量為300～500 g,世界衛(wèi)生組織推薦標準為每人每天攝入量不應(yīng)少于400 g。目前,我國還沒有蔬菜中正常生理濃度的硫氰酸鹽和高氯酸鹽限值規(guī)定,歐洲食品安全局(EFSA)設(shè)定高氯酸鹽的每日容許攝入量(TDI)為0.3 μg/kg體質(zhì)量,如果以60 kg正常成年人每天攝入蔬菜量400 g計算,6類新鮮蔬菜高氯酸鹽平均含量為0.098 mg/kg,高氯酸鹽的攝入量為 0.65 μg/kg體質(zhì)量,已超過了EFSA設(shè)定的限值。由于本實驗所選的8類蔬菜無法完全代表居民正常的每天蔬菜攝入量,同時蔬菜中還含有較高的硫氰酸鹽,因此蔬菜中的硫氰酸鹽和高氯酸鹽對人體健康風險需要更深入的研究和評估。

3 結(jié)論

本文建立了同時分析蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的檢測方法,重點簡化了以超聲輔助超純水提取、離心后直接過膜分析的前處理技術(shù)以及采用超強親水性色譜柱分離、中等濃度氫氧化鉀淋洗液洗脫的快速分離技術(shù),本方法硫氰酸鹽和高氯酸鹽分別在0.2～5.0和0.04～1.00 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.9997和0.9989,檢出限分別為0.005、0.008 mg/L,方法回收率分別為89.9%～98.4%和81.2%～94.4%,分析方法準確可靠、靈敏度高,可滿足同時測定蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的檢測要求。