響應(yīng)面法優(yōu)化獼猴桃葉綠素提取工藝

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(三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院,湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心, 生物催化宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北宜昌 443002)

獼猴桃是獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬植物的一種漿果,又稱獼猴梨、藤梨、羊桃、毛木果等,原產(chǎn)于中國(guó)湖北宜昌,是20世紀(jì)人工馴化栽培野生果樹最早且最優(yōu)的四大樹種之一,其營(yíng)養(yǎng)豐富,風(fēng)味獨(dú)特,經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,而被譽(yù)為“水果之王”,深受消費(fèi)者的青睞,尤其因其果實(shí)富含維生素C,而有“VC之王”的美譽(yù)[1]。獼猴桃果肉顏色各異,主要有綠肉、黃肉和紅肉3種,其綠肉獼猴桃果實(shí)含有大比例的葉綠素和低含量的類胡蘿卜素,獼猴桃果實(shí)及其加工品不僅可以增進(jìn)食欲、滋補(bǔ)強(qiáng)身、防癌、抗氧化、抗衰老、提高身體免疫機(jī)能,提高運(yùn)動(dòng)能力,還能有效調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化,降低血液中膽固醇和甘油二酯,對(duì)糖尿病和特異性皮炎均有良好治療效果[2-3]。

綠肉獼猴桃中葉綠素含量高,葉綠素具有抗癌、抑菌、抗氧化、護(hù)肝、抗突變、抗貧血等藥理作用[4-6],同時(shí)葉綠素作為天然色素,可應(yīng)用于醫(yī)療、食品、化妝品等行業(yè)。葉綠素不穩(wěn)定,在熱、酸、光照、氧氣、酶等條件下極易發(fā)生降解,生成黃褐色或深褐色產(chǎn)物[7-8]。獼猴桃果實(shí)酸含量高,在加工過程中遇熱易降解,但熱處理又是果蔬產(chǎn)品加工中滅酶、滅菌必不可少的工序,所以護(hù)綠難度大。在工業(yè)上,堿液護(hù)綠、金屬離子護(hù)綠、高溫短時(shí)熱處理護(hù)綠應(yīng)用范圍最廣[9]。

近年來,葉綠素提取較成熟的方法有:有機(jī)溶劑萃取法,此法根據(jù)對(duì)材料的前處理方式分為研磨法和浸提法[10];微波萃取法,具有熱效率高、便于控制、選擇性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)[11];超臨界二氧化碳萃取法,具有萃取速度高、常溫操作、傳熱速率快、易控制等特點(diǎn)[12];超聲波法,具有安全性好、操作簡(jiǎn)單、萃取效率高、成本低等優(yōu)勢(shì)[13]。

目前對(duì)綠肉獼猴桃中葉綠素提取工藝的報(bào)道較少,其主要用Arnon法的公式計(jì)算值作為研究指標(biāo),計(jì)算較繁瑣。本文以宜昌綠肉獼猴桃為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用浸提法提取葉綠素,用響應(yīng)面優(yōu)化其提取工藝條件,并以全波長(zhǎng)掃描法直接測(cè)定的OD值和由Arnon法公式的計(jì)算值作為指標(biāo),進(jìn)行比較分析為簡(jiǎn)化相關(guān)數(shù)據(jù)分析工作提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮綠肉獼猴桃 當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買;無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮 均為分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

FW177中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司公司;JLL30-A食物攪碎器 順德市希貴電器制造有限公司;ME204E電子天平 梅特勒-托厲多儀器(上海)有限公司;754紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司制造,LXJ-IIB低速臺(tái)式大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-2水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司;EV312旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;HB-03加熱鍋 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;SHZ-0(III)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 島津制作所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 獼猴桃→去皮打漿→勻漿稱量→提取→離心→減壓濃縮→定容→葉綠素提取液→測(cè)定[14-15]

操作要點(diǎn):提取劑為丙酮和乙醇時(shí),取樣20 g;提取劑為乙酸乙酯時(shí),取樣10 g;提取液離心轉(zhuǎn)數(shù)為5000 r·min-1,時(shí)間10 min,減壓濃縮水浴溫度為35 ℃。在相同提取條件下,提取劑為丙酮和乙醇的提取液,測(cè)定的OD值在0.1左右,為使得OD值在0.2～0.8范圍內(nèi),丙酮和乙醇提取液濃縮至5 mL測(cè)定,而乙酸乙酯提取液測(cè)定的OD值在該范圍內(nèi)。

為了檢驗(yàn)OD666值和葉綠素提取含量變化趨勢(shì)是否一致,以及驗(yàn)證不同條件下此法的適用性和準(zhǔn)確性,且只有在得到每種溶劑最優(yōu)工藝條件下的結(jié)果,才能確定哪種溶劑提取效果好。所以在單因素實(shí)驗(yàn)中采用三種溶劑及其不同條件下提取葉綠素。

1.2.2 葉綠素a(Chlorophyll a)和葉綠素b(Chlorophyll b)提取含量測(cè)定 采用分光光度計(jì)比色法,參考Arnon的方法[16-17]。分別測(cè)定663和645 nm下的吸光度。按下式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b的含量。

Chl(μg/g)=Chla+Chlb

式中,Chla、Chlb分別為葉綠素a、b提取含量;Chl為總?cè)~綠素提取含量;v為提取劑的體積,單位mL;m為果漿質(zhì)量,單位g;n為濃縮倍數(shù);OD663為663 nm下的吸光度值;OD645為645 nm下的吸光度值。

1.2.3 果漿中葉綠素提取液吸光值測(cè)定 將待測(cè)的葉綠素提取液濃縮至適宜濃度,采用紫外可見全波長(zhǎng)掃描儀進(jìn)行掃描,確定提取液最適吸收波長(zhǎng),在此吸收波長(zhǎng)下,以分光光度計(jì)法[12-13]測(cè)定果漿提取液中吸光值。

1.2.4 葉綠素提取的單因素實(shí)驗(yàn) 將獼猴桃勻漿,以葉綠素提取含量和666 nm下的吸光值(OD666)為測(cè)定指標(biāo),OD666的值對(duì)應(yīng)葉綠素提取含量,在固定液料比1.5∶1 mL/g、提取時(shí)間3 h、提取溫度60 ℃的情況下,研究不同乙酸乙酯濃度(10%、20%、40%、60%、80%、100%)、不同丙酮濃度(50%、70%、80%、90%、100%)和不同乙醇濃度(60%、70%、80%、90%、100%)對(duì)葉綠素提取含量和OD666的影響;固定提取溫度60 ℃、提取時(shí)間3 h,研究液料比(60%乙酸乙酯:0.9∶1、1.2∶1、1.5∶1、1.8∶1、2.1∶1 mL/g)、液料比(80%乙醇:0.7∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.5∶1、2.0∶1 mL/g)、液料比(100%丙酮:0.5∶1、0.7∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.5∶1 mL/g)對(duì)葉綠素提取含量和OD666的影響;在固定提取時(shí)間3 h,乙酸乙酯濃度60%、液料比1.2∶1 mL/g,丙酮濃度100%、液料比1.0∶1 mL/g,乙醇濃度80%、液料比2.0∶1 mL/g條件下,研究溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對(duì)葉綠素提取含量和OD666的影響;在固定提取溫度60 ℃,乙酸乙酯濃度60%、液料比1.2∶1 mL/g,丙酮濃度100%、液料比1.0∶1 mL/g,乙醇濃度80%、液料比2.0∶1 mL/g條件下,研究提取時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)對(duì)葉綠素提取含量和OD666的影響。為提高試驗(yàn)的可靠性,該試驗(yàn)中每組數(shù)據(jù)重復(fù)做3次。

1.2.5 Box-Behnken法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),利用Designexpert 8.0.6軟件,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)方法,確定提取劑為乙酸乙酯,以提取劑濃度、料液比、提取時(shí)間及提取溫度作為自變量,以獼猴桃果肉中葉綠素提取液的吸光值作為響應(yīng)值,進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn),各因素的3個(gè)水平采用-1、0、1進(jìn)行編碼,如表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factor level design of response surface test

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

由圖1可知,不同提取劑下提取的色素吸收峰一致,在415和666 nm(圖1)有兩個(gè)吸收峰。葉綠素在藍(lán)紫區(qū)(400～450 nm)和紅光區(qū)(620～700 nm)具有強(qiáng)烈吸收,但類胡蘿卜素在藍(lán)紫區(qū)(400～450 nm)也有強(qiáng)烈吸收,同時(shí)為避免黃酮類和糖類等物質(zhì)在紫外吸收區(qū)域的影響,采用測(cè)定波長(zhǎng)為666 nm[17-19]。

圖1 不同提取劑下的紫外全波長(zhǎng)掃描Fig.1 UV full-wavelength scanning of different extractants

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同提取溶劑濃度對(duì)綠肉獼猴桃中葉綠素提取的影響 由圖2可知,不同提取溶劑對(duì)綠肉獼猴桃中葉綠素的OD666值及葉綠素提取含量均有顯著影響(p<0.05),且其OD666值與葉綠素提取含量變化趨勢(shì)一致;隨乙酸乙酯與乙醇濃度增加,OD666值和葉綠素提取含量先增后減,葉綠素為脂溶性色素,乙酸乙酯微溶于水,葉綠素溶于乙酸乙酯中,與水相分層。葉綠素提取液中含水量對(duì)葉綠素提取含量測(cè)定和穩(wěn)定性影響較大[19];隨丙酮濃度增加,OD666值和葉綠素提取含量持續(xù)增加;乙酸乙酯最佳濃度為60%、丙酮最佳濃度為100%、乙醇最佳濃度為80%;提取效果最好溶劑為乙酸乙酯,顯著高于丙酮和乙醇(p<0.05)。

圖2 溶劑種類及濃度對(duì)葉綠素提取含量的影響Fig.2 Effects of solvent types and concentrations on chlorophyll extraction contents

2.2.2 不同液料比對(duì)綠肉獼猴桃中葉綠素提取的影響 由圖3可知,不同液料比對(duì)綠肉獼猴桃中葉綠素的OD666值及葉綠素提取含量均有顯著影響(p<0.05),且其OD666值與葉綠素提取含量變化趨勢(shì)一致;3種溶劑在固定條件下都隨液料比升高,OD值與葉綠素提取含量先升后降。這是因?yàn)橐毫媳鹊脑黾佑欣谌~綠素浸出,葉綠素提取含量增加;而液料比過高時(shí),溶劑的增加會(huì)影響浸提體系的傳熱和傳質(zhì),不利于葉綠素的提取[20]。乙酸乙酯提取最佳液料比為1.2∶1 mL/g、乙醇為2.0∶1 mL/g、丙酮為1.0∶1 mL/g,其中乙酸乙酯提取效果顯著差異顯著高于丙酮和乙醇提取效果(p<0.05)。

2.2.3 不同提取溫度對(duì)綠肉獼猴桃中葉綠素提取的影響 由圖4可知,不同提取溫度對(duì)綠肉獼猴桃中葉綠素的OD666值及葉綠素提取含量均有顯著影響(p<0.05),且其OD666值與葉綠素提取含量變化趨勢(shì)一致;三種溶劑在固定條件下都隨提取溫度升高,OD666值與葉綠素提取含量先升后降。主要是因?yàn)?溫度升高,分子移動(dòng)速率加快,使得葉綠素分子與蛋白分離的速率及溶出的速率上升;但在原料一定的情況下,溫度差的影響逐漸降低,溫度過高之后,獼猴桃果肉中雜質(zhì)溶出速率超過葉綠素溶出速率,會(huì)使吸光度下降[21]。最佳提取溫度都在60 ℃,其中乙酸乙酯提取效果最佳,顯著高于丙酮和乙醇(p<0.05)。

2.2.4 不同提取時(shí)間對(duì)綠肉獼猴桃中葉綠素提取的影響 由圖5知,不同提取時(shí)間對(duì)綠肉獼猴桃中葉綠素的OD666值及葉綠素提取含量均有顯著影響(p<0.05)。隨著提取時(shí)間的增加,葉綠素提取含量先升高后下降。這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長(zhǎng),初始提取出的葉綠素部分發(fā)生了降解所導(dǎo)致的[22],且其OD666值與葉綠素提取含量變化趨勢(shì)一致。乙酸乙酯最佳提取時(shí)間為4 h、丙酮最佳為3 h、乙醇最佳為5 h。其中乙酸乙酯提取效果最佳,顯著高于丙酮和乙醇(p<0.05)。

圖5 時(shí)間對(duì)葉綠素提取含量的影響Fig.5 Effects of time on extraction of chlorophyll

綜上所述,在單因素實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),全波長(zhǎng)掃描后直接測(cè)定的OD666值和Arnon法的公式計(jì)算值變化趨勢(shì)一致,即可用OD值代替Arnon法計(jì)算值來作為判斷葉綠素提取效果的指標(biāo)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)葉綠素提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 回歸模型的建立 利用響應(yīng)面方法對(duì)葉綠素的提取工藝進(jìn)行方案分析(表2),利用DesignExpert 8.0.6軟件對(duì)得到的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合。因單因素試驗(yàn)得出OD666值與通過Arnon法得到的葉綠素提取含量變化趨勢(shì)一致,且乙酸乙酯提取效果最好。此方法能準(zhǔn)確地反應(yīng)出對(duì)葉綠素的提取效果,并減少工作量,所以此處直接以O(shè)D666值為指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),取其平均值為響應(yīng)值,與提取時(shí)間、提取溫度、提取劑濃度、液料比4個(gè)因素之間建立的二次多項(xiàng)回歸方程:

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Analysis scenarios and results of response surface method

Y=-6.594+0.044A+1.295B+0.040C+0.106D-1.450×10-3AB+1.624×10-4AC+4.10×10-4AD-2.50×10-4BC+2.60×10-3BD+1.225×10-3CD-5.403×10-4A2-0.173B2-4.977C2-1.316×10-3D2

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.3.3 兩因素交互作用分析 由圖6可知,響應(yīng)曲面的走勢(shì)陡峭,等高線密集且呈橢圓形。提取劑濃度與提取溫度交互作用對(duì)葉綠素提取液OD值的影響表現(xiàn)為顯著水平。葉綠素提取液OD值隨乙酸乙酯體積分?jǐn)?shù)的增大和溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì),這可能是因?yàn)橐宜嵋阴O性較弱,體積分?jǐn)?shù)增大反而減小了提取液的極性,使其更接近于葉綠素的極性,從而增加了葉綠素的溶出效果。但部分葉綠素是以和蛋白質(zhì)結(jié)合的形態(tài)存在于植物細(xì)胞中,適量水分可使葉綠素親水基團(tuán)與蛋白分離,利于從內(nèi)囊體膜游離出來,水份過高對(duì)提取不利[23];同時(shí)溫度過高也會(huì)導(dǎo)致部分葉綠素降解。

圖6 提取溫度與提取劑濃度的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.6 Response surface map and contour plot of extraction temperature and extractant concentration

圖7中,液料比與溫度的等高線為橢圓,表明二者交互效應(yīng)對(duì)響應(yīng)值的影響顯著,與方差分析結(jié)果一致。葉綠素提取液OD值隨液料比的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。增加液料比可增加傳質(zhì)動(dòng)力,有助于葉綠素的溶出[24],但當(dāng)液料比達(dá)到一定程度時(shí),已溶出大部分葉綠素,若再增加液料比,則葉綠素提取率增加緩慢,使提取濃度降低,從而導(dǎo)致響應(yīng)值降低。

圖7 溫度與液料比的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.7 Response surface diagram and contour plot of temperature to liquid ratio

2.3.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化與模型驗(yàn)證 通過軟件Design Expert 8.0.6分析得出提取綠肉獼猴桃葉綠素的最佳條件為:提取時(shí)間3.93 h,乙酸乙酯濃度59.62%,提取溫度59.15 ℃,液料比1.218∶1 mL/g?？紤]到實(shí)際工作的便利,將浸提工藝修正為液料比1.22∶1 mL/g,乙酸乙酯濃度59.6%,提取時(shí)間236 min,提取溫度59 ℃。采用修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得葉綠素OD666值為0.636±0.01,與模型預(yù)測(cè)值0.640相對(duì)誤差小于5%,此時(shí)通過Arnon法測(cè)得葉綠素含量為27.73 μg/g,比張麗華等[9]測(cè)得“秦美”獼猴桃中葉綠素含量高,證明了采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)比較準(zhǔn)確,具有使用價(jià)值。

3 結(jié)論

研究表明,提取劑類型、料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取劑濃度均對(duì)葉綠素提取有不同程度的影響,且本實(shí)驗(yàn)中得出獼猴桃葉綠素的最佳提取溶劑為乙酸乙酯。通過Box-Behnken設(shè)計(jì),建立了四元二次回歸方程,得到獼猴桃葉綠素最佳提取工藝為:液料比1.22∶1 mL/g,乙酸乙酯濃度59.6%,提取時(shí)間236 min,提取溫度59 ℃,OD666值為0.636,此時(shí)通過Arnon法測(cè)得葉綠素含量為27.73 μg/g。響應(yīng)面模型實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差小于5%,故該模型能反映綠肉獼猴桃葉綠素提取過程中的內(nèi)部規(guī)律,可較好地預(yù)測(cè)獼猴桃葉綠素的提取情況,并能為拓寬葉綠素提取原料的來源、進(jìn)一步提高綠肉獼猴桃資源利用率及綠肉獼猴桃葉綠素工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。