響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2 流體萃取淮山多糖工藝

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(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南株洲 412004)

淮山(DioscoreaoppositaThunb.)在我國有廣泛的種植,是傳統(tǒng)的藥食兩用植物[1]?；瓷蕉嗵蔷哂薪档脱荹2]、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗衰老、抗突變等作用[3],從淮山中提取多糖,對(duì)充分利用淮山資源、促進(jìn)淮山產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要意義。

目前淮山多糖的提取方法主要有熱水浸提、堿法提取[4]、微波輔助提取[5]、超聲波輔助提取[3]等,這些方法使淮山多糖生物活性降低,同時(shí)使用的溶劑量較大,造成后續(xù)分離的困難。超臨界流體萃取、亞臨界萃取技術(shù)是近幾十年新發(fā)展起來的提取技術(shù),具有能耗小、效率高、無污染、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[6-8],能夠在保持萃取物生物活性的同時(shí)降低后續(xù)分離難度。研究表明[9-12],超臨界流體萃取、亞臨界萃取技術(shù)在萃取黑木耳多糖、香菇多糖、金針菇多糖時(shí),相較于傳統(tǒng)方法,多糖萃取率有顯著提升。

本試驗(yàn)采用超臨界CO2流體萃取技術(shù),考察萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、夾帶劑乙醇濃度四個(gè)因素,利用響應(yīng)面分析法對(duì)淮山多糖的萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化,為淮山多糖的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淮山 株洲市湘天橋菜市場(chǎng),并經(jīng)鑒定為淮山(DioscoreaoppositaThunb.);D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.9%) 中國食品藥品檢定研究院;乙醚 天津富宇精細(xì)化工有限公司;苯酚 天津市永大化學(xué)試劑有限公司;硫酸 成都市科龍化工試劑廠;所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

HA121-50-01型超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)、AUW220D型分析天平 島津制作所;DHS-20A自動(dòng)快速水分測(cè)定儀 上海力辰儀器科技有限公司;DZ24T型真空干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淮山多糖的萃取 取新鮮的淮山去除雜質(zhì)、洗凈,60 ℃真空干燥,快速水分測(cè)定儀檢測(cè)其含水量小于5%。粉碎成一定目的顆粒,用10倍乙醚浸提3次脫脂,揮發(fā)去樣品中的乙醚,樣品置干燥器中干燥,備用。稱取經(jīng)乙醚脫脂處理的淮山樣品300 g,應(yīng)用超臨界CO2流體萃取裝置萃取淮山多糖;萃取物于50 ℃下真空減壓濃縮,濃縮液按1∶3 (V/V)比例加入無水乙醇,靜置過夜,過濾,將過濾得到的沉淀物置表面皿上真空干燥后得淮山粗多糖。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1方法萃取淮山粗多糖,探究夾帶劑用量為100 mL時(shí),萃取溫度(20、30、40、50、60 ℃)、萃取壓力(20、25、30、35、40 MPa)、萃取時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、夾帶劑乙醇濃度(0、20%、40%、60%、80%)、樣品粒度(10、30、50、70、90目)5個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響。萃取溫度、萃取壓力、帶劑乙醇濃度和樣品粒度5個(gè)因素的固定水平分別為50 ℃、35 MPa、2.0 h、60%和40目,在對(duì)各因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)探究時(shí),其他因素均取固定水平。

1.2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化多糖提取工藝參數(shù) 以淮山多糖萃取得率為考查指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取超臨界CO2流體萃取淮山多糖的萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、夾帶劑乙醇濃度為試驗(yàn)因素,根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化淮山多糖的提取工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.2.4 淮山多糖萃取得率的計(jì)算

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1.0 g,配成濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品貯備液,從中分別精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于25 mL具塞試管中,各加水至1.0 mL,各加5%苯酚溶液1.5 mL,振搖混勻,滴加濃硫酸5.0 mL,迅速振搖均勻,于50 ℃下放置30 min,取出后冷卻至室溫,紫外可見分光光度法于490 nm波長下測(cè)定吸光度值[13-14],以樣品濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光度值y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 淮山多糖的測(cè)定 精密稱取1.2.1法制備的淮山粗多糖0.5 g,溶解,定容于100 mL容量瓶中;從中精密量取1.0 mL,定容于100 mL容量瓶中,制成待測(cè)樣品溶液;精密量取待測(cè)樣品溶液1.0 mL,按1.2.4.1法測(cè)定淮山粗多糖吸光度值,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算淮山多糖含量,計(jì)算萃取得率[13-14]。

淮山多糖萃取得率(%)=C×V/m×100

其中:C:淮山多糖質(zhì)量濃度,g/mL;V:經(jīng)超臨界萃取所得萃取物樣品溶液體積,mL;m:淮山樣品質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert.V 8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以樣品濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光度值y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.00626x-0.0038,R2=0.9991,在0～100 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Glucose standard curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 超臨界CO2流體萃取溫度對(duì)淮山多糖萃取得率的影響 由圖2可知溫度對(duì)淮山多糖萃取得率的影響明顯。在20～40 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高,淮山多糖萃取得率不斷提升,這可能是由于溫度升高,加速了CO2流體的熱運(yùn)動(dòng),同時(shí)也提高了多糖分子熱運(yùn)動(dòng),加速了淮山多糖的溶出和轉(zhuǎn)移;在40～50 ℃范圍內(nèi),淮山多糖萃取得率隨溫度升高變化不大,這可能是由于淮山原料顆粒內(nèi)外多糖轉(zhuǎn)移達(dá)到平衡所致;萃取溫度高于50 ℃時(shí),萃取得率隨溫度的升高而緩慢下降,這可能是在壓力一定的情況下,超臨界CO2流體密度隨著溫度升高而降低,溶劑化效應(yīng)下降,淮山多糖在其中的溶解度降低導(dǎo)致萃取得率下降,也可能是部分多糖在較高溫度下被氧化、分解,導(dǎo)致多糖萃取得率降低。因此,萃取溫度選取50 ℃。

圖2 萃取溫度對(duì)淮山多糖萃取得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.2.2 超臨界CO2流體萃取壓力對(duì)淮山多糖萃取得率的影響 由圖3可知,在20～30 MPa范圍內(nèi),淮山多糖的萃取得率隨著壓力的增大而不斷升高,這可能是因?yàn)樵跍囟纫欢ǖ臈l件下,超臨界CO2流體的密度隨壓力的升高而升高,流體溶劑化效應(yīng)增強(qiáng),淮山多糖的溶出增加、溶解度加大導(dǎo)致的;在30～40 MPa范圍內(nèi),淮山多糖的萃取得率隨超臨界CO2流體壓力的增加變化不大,這可能和萃取壓力增加,超臨界CO2流體密度增加,擴(kuò)散性降低,淮山多糖傳質(zhì)速率降低,與壓力升高導(dǎo)致的溶解度增大之間達(dá)到平衡有關(guān);同時(shí)萃取壓力增大也會(huì)導(dǎo)致設(shè)備、操作費(fèi)用的升高。因此,萃取壓力選取35 MPa。

圖3 萃取壓力對(duì)淮山多糖萃取得率的影響Fig.3 Effects of extraction pressure on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.2.3 超臨界CO2流體萃取時(shí)間對(duì)淮山多糖萃取得率的影響 由圖4可知,在1～2 h時(shí)間范圍內(nèi),淮山多糖的萃取得率隨萃取時(shí)間的延長而提高,這可能是因?yàn)榛瓷蕉嗵窃诙虝r(shí)間內(nèi)不能充分溶出,萃取時(shí)間延長,淮山多糖從原料顆粒中充分溶出導(dǎo)致的。在2～2.5 h時(shí)間范圍內(nèi),萃取得率隨萃取時(shí)間的延長變化不大,這可能是淮山多糖的溶出達(dá)到平衡所致;在2.5～3 h時(shí)間范圍內(nèi),萃取得率隨萃取時(shí)間的延長而降低,可能是因?yàn)橛胁糠只瓷蕉嗵潜谎趸?、分解所致。因?萃取時(shí)間選取2.5 h。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)淮山多糖萃取得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.2.4 超臨界CO2流體萃取夾帶劑乙醇濃度對(duì)淮山多糖萃取得率的影響 由圖5可知夾帶劑濃度能明顯改變超臨界CO2流體的萃取性能。在未添加夾帶劑的情況下,由于超臨界CO2流體的弱極性和淮山多糖的不揮發(fā)性,淮山多糖的萃取得率較低;隨著夾帶劑濃度在0～60%之內(nèi)增加,超臨界CO2流體的極性改變,淮山多糖萃取得率隨之提高;當(dāng)夾帶劑濃度在60%～80%內(nèi)增加時(shí),淮山多糖萃取得率隨夾帶劑濃度的升高而降低,這可能是因?yàn)橐掖紳舛冗^高,淮山多糖在其中的溶解度降低導(dǎo)致的。因此,夾帶劑乙醇濃度選取60%。

圖5 萃取夾帶劑乙醇濃度對(duì)淮山多糖萃取得率的影響Fig.5 Effects of extraction cosolvent on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.2.5 淮山粒度對(duì)淮山多糖萃取得率的影響 由圖6可知,淮山粒度對(duì)多糖得率影響不明顯?；瓷搅６仍?0～50目范圍內(nèi)增加時(shí),淮山多糖的萃取得率隨之增加,這可能是由于在此粒度范圍內(nèi),原料顆粒減小,超臨界CO2流體能夠進(jìn)入顆粒內(nèi)部進(jìn)行充分交換所致。當(dāng)粒度在50～70目范圍內(nèi)增加時(shí),淮山多糖萃取得率變化不明顯;當(dāng)粒度在70～90目范圍內(nèi)增加時(shí),淮山多糖的萃取得率減少,這可能是較小的淮山樣品粒度在萃取過程中發(fā)生結(jié)塊現(xiàn)象,導(dǎo)致多糖溶出減少所致;也可能是較小的淮山顆粒堵塞萃取隔板小孔,使萃取產(chǎn)物不能及時(shí)轉(zhuǎn)移到分離缸造成的。因50～70目時(shí)的萃取得率無顯著性差異,趨勢(shì)基本平穩(wěn),為了操作方便,后續(xù)實(shí)驗(yàn)固定淮山樣品粒度為60目。

圖6 淮山粒度對(duì)淮山多糖萃取得率的影響Fig.6 Effects of particle size on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過響應(yīng)面法對(duì)超臨界CO2流體萃取淮山多糖的溫度、壓力、時(shí)間、夾帶劑乙醇濃度4個(gè)因素進(jìn)行設(shè)計(jì),試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental desigen and results for response surface analysis

采用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得淮山多糖萃取得率Y對(duì)各因素回歸方程為:Y=0.26+0.016A+0.042B-3.333×10-3C+7.500×10-3D-7.500×10-3AB-1.000×10-2AD+0.033BD+1.000×10-2CD-8.917×10-2A2-0.025B2-7.667×10-3C2-0.049D2

表3 回歸模型與方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

該模型擬合程度好,結(jié)果可靠,可以用該模型對(duì)淮山多糖萃取結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由回歸方程和方差分析可知,模型中A、B、BD、B2、D2對(duì)淮山多糖萃取得率的影響為極顯著(p<0.01);D對(duì)淮山多糖萃取得率的影響為顯著(p<0.05)。各因素對(duì)淮山多糖萃取得率的影響依次為B>A>D>C,即萃取壓力>萃取溫度>夾帶劑濃度>萃取時(shí)間。

2.3.1 響應(yīng)面分析 圖7表示各影響因素兩兩作用對(duì)淮山多糖萃取得率的交互影響。由圖7a可知,萃取溫度與萃取壓力對(duì)淮山多糖萃取得率的交互作用不顯著(p=0.2116>0.05)。壓力一定時(shí),多糖萃取得率隨溫度升高而增加;溫度一定時(shí),多糖萃取得率隨壓力升高而升高。由圖7b可知,萃取溫度與萃取時(shí)間對(duì)淮山多糖萃取得率的交互作用不顯著(p=1.00>0.05)。由圖7c可知,萃取溫度與夾帶劑濃度對(duì)淮山多糖萃取得率的交互作用不顯著(p=0.1028>0.05)。由7d可知,萃取壓力與萃取時(shí)間對(duì)淮山多糖萃取得率的交互作用不顯著(p=1.00>0.05)。由圖7e可知,萃取壓力與夾帶劑濃度對(duì)淮山多糖萃取得率的交互作用極顯著(p<0.01)。夾帶劑濃度較低時(shí),多糖萃取得率隨壓力的升高而先升高后降低;夾帶劑濃度較高時(shí),多糖萃取得率隨壓力的升高而升高;壓力較低時(shí),多糖萃取得率隨夾帶劑濃度增加而先升高后略有降低;壓力較高時(shí),多糖萃取得率隨夾帶劑濃度增加先略有升高后降低。由圖7f可知,萃取時(shí)間與夾帶劑濃度對(duì)淮山多糖萃取得率的交互作用不顯著(p=0.1028>0.05)。

圖7 各因素交互作用對(duì)淮山多糖萃取得率的影響Fig.7 Response surface plots for the effects of any two variables on extraction rate of polysaccharides

2.3.2 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過建立的模型預(yù)測(cè)淮山多糖的最佳萃取工藝為:萃取溫度52.50 ℃、萃取壓力45.00 MPa、萃取時(shí)間2.53 h、夾帶劑乙醇濃度67.72%,理論萃取得率為0.287%?？紤]到操作的實(shí)際情況,將最佳工藝條件修訂為:萃取溫度53 ℃、萃取壓力45 MPa、萃取時(shí)間2.5 h、夾帶劑乙醇濃度68%。在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),做重復(fù)試驗(yàn)3次,淮山多糖萃取得率平均為0.2807%±0.0045%,與預(yù)測(cè)值較為接近,表明該模型能夠模擬和預(yù)測(cè)淮山多糖的萃取,模型可靠。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2流體萃取淮山多糖的工藝,結(jié)果顯示二次響應(yīng)面模型擬合度較高,可用于淮山多糖提取預(yù)測(cè)與優(yōu)化。萃取溫度、萃取壓力及夾帶劑濃度對(duì)多糖萃取得率作用顯著(p<0.05),萃取壓力和夾帶劑濃度之間存在極顯著(p<0.01)交互作用。超臨界CO2流體萃取淮山多糖的最佳工藝條件為:萃取溫度53 ℃、萃取壓力45 MPa、萃取時(shí)間2.5 h、夾帶劑乙醇濃度68%,該條件下淮山多糖萃取得率為0.2807%±0.0045%。本研究為淮山多糖的提取工藝提供了參考,為淮山多糖的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。