以合成桔霉素的關(guān)鍵基因?yàn)榘袠?biāo)的 PCR檢測(cè)方法與UPLC法檢測(cè)紅曲中 桔霉素含量的一致性分析

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(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

紅曲是以大米為主要原料,經(jīng)紅曲菌(Monascusspp.,也稱紅曲霉)[1]發(fā)酵而成的固態(tài)產(chǎn)物。紅曲在我國(guó)及東南亞地區(qū)已有近2千年的應(yīng)用歷史,被廣泛用作食品著色劑[2]、防腐劑[3]、發(fā)酵劑[4]和中藥配伍[5]等,同時(shí)也是我國(guó)的傳統(tǒng)出口產(chǎn)品。但1995年法國(guó)學(xué)者Blanc首次發(fā)現(xiàn)某些紅曲菌株能夠分泌一種真菌毒素——桔霉素(citrinin,CIT),該物質(zhì)具有較強(qiáng)的腎臟毒性,還可以致畸、誘發(fā)腫瘤、致突變等[6-9],故紅曲及其生產(chǎn)菌株的安全性問題備受人們的關(guān)注;紅曲中的CIT問題也一度成為我國(guó)紅曲產(chǎn)品出口及新產(chǎn)品開發(fā)的限制性因素。日本、韓國(guó)制定了紅曲色素中桔霉素的限量標(biāo)準(zhǔn);我國(guó)也先后頒布了功能性紅曲米[10]和食品添加劑紅曲紅產(chǎn)品中桔霉素限量標(biāo)準(zhǔn)[11]。因此,如何控制紅曲產(chǎn)品中桔霉素含量,使其符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)成為重要的課題。

近年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過研究得到了一些控制紅曲產(chǎn)品中桔霉素含量的有效方法,主要包括低產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素菌株的篩選[12]、發(fā)酵條件優(yōu)化[13-15]以及基因工程改造[16]等方法。在這些方法中,無論是建立新的發(fā)酵工藝條件還是改造的基因工程菌均不適合紅曲的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝要求,因此篩選低產(chǎn)或不產(chǎn)CIT的菌株就成為首選方法,而有效的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法將會(huì)大大減少菌種篩選的工作量。

本研究以25株不同來源的紅曲菌為研究對(duì)象,考察其基因組中是否含有桔霉素合成的關(guān)鍵基因片段,同時(shí)采用免疫親和柱層析與UPLC結(jié)合的方法檢測(cè)這些菌株在傳統(tǒng)發(fā)酵工藝條件下制備紅曲中桔霉素的含量,探討菌株中桔霉素合成關(guān)鍵基因存在情況與相應(yīng)菌株發(fā)酵制備紅曲中桔霉素含量之間是否具有一致性。研究結(jié)果為判斷傳統(tǒng)發(fā)酵工藝生產(chǎn)的紅曲產(chǎn)品中桔霉素含量是否符合QB/T 2847-2007功能性紅曲米(粉)的桔霉素限量標(biāo)準(zhǔn)(50 μg/kg)提供參考依據(jù),也為評(píng)價(jià)菌株生產(chǎn)桔霉素的能力提供基本信息。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

25株實(shí)驗(yàn)用菌株 為MY1、MY2、MY3、ZH1、ZH2、ZH3、ZH4、ZH5、JC1、JC2、MG1、MG2、MG3、MF2、MF3、MS1、MS3、GW1、GW2、GW3、GW4、GW5、GW6、GW7、MS2,其中前17株菌株分離自17種不同類型的紅曲產(chǎn)品,GW1～GW7購(gòu)買自荷蘭菌種保藏中心(對(duì)應(yīng)的編號(hào)分別為CBS 554.76、CBS 302.78、CBS 736.83、CBS 123568、CBS 254.65、CBS 290.34和CBS 291.34),MS2購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心(對(duì)應(yīng)的編號(hào)為AS 3.5838);Easy Taq DNA Polymerase、Trans 2K plus marker和Trans 15K Marker 北京全式金生物有限公司;RNase A、LA Taq DNA Polymerase 寶生物技術(shù)(北京)有限公司;桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉丁公司;常規(guī)化學(xué)試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ACQUITY UPLC H-Class超高相液相色譜儀 美國(guó)Waters公司;T960型PCR儀 上海Heal Force公司;DYY-8C型凝膠成像系統(tǒng) 北京六一電泳儀器廠;Neofuge 18R型高速冷凍離心機(jī) 上海Heal Force公司;不銹鋼五谷雜糧磨粉機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 MEA(麥芽提取粉瓊脂培養(yǎng)基):麥芽汁提取粉20 g、蛋白胨1.0 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL加熱溶解,分裝后121 ℃滅菌20 min。

米飯培養(yǎng)基制備:取一定量秈稻米,浸泡3 h瀝干,稱取50 g瀝干后的大米分裝于250 mL的三角瓶中,121 ℃滅菌20 min,趁熱用手拍打三角瓶至米粒均勻不結(jié)塊,冷卻后備用。

1.2.2 紅曲的制備 將菌株接種于PDA斜面上活化,28 ℃培養(yǎng)10 d后,加入5 mL無菌蒸餾水洗孢子,洗出液用三層擦鏡紙過濾除去菌絲,玻璃珠振搖打散約10 min,采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)取106個(gè)/mL孢子液1 mL接種于制備好的米飯培養(yǎng)基的三角瓶中,混勻,間隔24 h以2 mL/瓶補(bǔ)加無菌水一次,且連續(xù)補(bǔ)水3 d,在28 ℃靜置發(fā)酵12 d,發(fā)酵期間觀察米粒,如有結(jié)塊現(xiàn)象,用手拍打三角瓶至米粒均勻不結(jié)塊。發(fā)酵完成后,將其于40 ℃烘干,以磨粉機(jī)粉碎并過60目篩,密封,于-20 ℃避光保存,待用。

1.2.3 紅曲菌菌株中合成桔霉素關(guān)鍵基因的PCR擴(kuò)增方法

1.2.3.1 紅曲菌基因組提取方法 將少量紅曲菌絲接種至鋪滿玻璃紙的MEA平板上,在28 ℃培養(yǎng)4 d,收集菌絲。取0.4～0.6 g菌絲放入滅菌的研缽中,加液氮迅速研磨成粉末,在粉末融化前以0.2 g/mL的比例加入在65 ℃預(yù)熱的5% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液,繼續(xù)研磨至完全混勻,轉(zhuǎn)入無菌離心管,在65 ℃水浴1 h,其間每10 min取出搖勻一次。取出樣品,冷卻至室溫后加入等體積的苯酚/氯仿(1∶1),充分混勻后在12000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移上清于新的2 mL離心管,加入等體積氯仿,充分混勻后在12000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移上清于新的2 mL離心管中,加入1/10體積的3 mol/L的NaAc和0.6倍體積的異丙醇,充分混勻后在-20 ℃沉淀30 min以上,在12000 r/min離心10 min。棄上清,沉淀用500 μL 75%乙醇洗滌,在12000 r/min離心5 min,棄上清液,重復(fù)洗滌一次。沉淀晾干后加入50 μL的TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH8.0)溶解,加5 μL的RNase A(10 mg/mL)37 ℃處理2 h,凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量,4 ℃一個(gè)月內(nèi)短期保存,或-20 ℃數(shù)年內(nèi)長(zhǎng)期保存[17-18]。

1.2.3.2 引物設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)以橙色紅曲菌桔霉素基因簇序列(EU309474.1)[19]中相關(guān)基因?yàn)槟０?采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)4對(duì)引物,分別針對(duì)ctnR、ctnE、pksCT和ctnA基因,又利用已設(shè)計(jì)引物,組合2對(duì)引物,共6對(duì)引物[20],相關(guān)序列信息如表1所示。

表1 擴(kuò)增桔霉素相關(guān)基因所用引物Table 1 Primers used to amplify citrinin related gene fragments

1.2.3.3 目的片段的PCR擴(kuò)增 以25種紅曲菌基因組DNA為模板,采用1.2.3.2中6對(duì)引物對(duì)目的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系如表2所示,PCR擴(kuò)增程序如表3所示。

表2 PCR擴(kuò)增25 μL反應(yīng)體系組成Table 2 Composition of 25 μL PCR amplification system

表3 PCR擴(kuò)增程序Table 3 PCR amplification program

1.2.3.4 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè) 采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),瓊脂糖濃度為1%,電泳儀恒定電壓120 V,電泳時(shí)間為25 min,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。其中由引物對(duì)5～6(表1)擴(kuò)增的產(chǎn)物,電泳時(shí)間為35 min。

1.2.4 桔霉素的檢測(cè)

1.2.4.1 UPLC測(cè)定桔霉素的條件 根據(jù)GB 5009.222-2016所示方法對(duì)樣品進(jìn)行提取。將收集得到的樣品提取液,采用超高效液相色譜(Ultra performance liquid chromategra-phy,UPLC)進(jìn)行桔霉素檢測(cè),使用熒光檢測(cè)器與二極管陣列檢測(cè)器(Photo-diode array,PDA),色譜條件:采用Waters 2695液相色譜儀,BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱,流動(dòng)相為梯度洗脫,流速0.3 mL/min,柱溫40 ℃,激發(fā)波長(zhǎng)331 nm,發(fā)射波長(zhǎng)500 nm[21]。

表4 流動(dòng)相及梯度洗脫條件Table 4 Mobile phase and gradient elution conditions

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取1～3 mg左右CIT固體標(biāo)準(zhǔn)品,甲醇定容至25 mL,作為母液。用UV-Vis分光光度計(jì)掃描母液的UV-Vis吸收光譜圖,測(cè)定在331 nm處的吸光值(摩爾吸光系數(shù)ε為5490 L/mol·cm),按照朗伯-比爾定律A=lg(1/t)=εbc,計(jì)算CIT母液濃度,并用甲醇稀釋至10 μg/mL作為CIT的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將母液和儲(chǔ)備液密封,4 ℃避光冷藏。配制濃度梯度范圍為50～1000 ng/mL的系列CIT標(biāo)準(zhǔn)工作液,應(yīng)用于UPLC-FLD標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

1.2.5 試樣中桔霉素含量計(jì)算 桔霉素含量計(jì)算方法參照GB 5009.222-2016,具體如下:

X=ρ×V×f/m

式中:X-試樣中桔霉素的含量(μg/kg);ρ-樣液中桔青霉素的濃度(μg/L);V-定容體積(mL);f-樣液稀釋倍數(shù);m-樣液所代表的試樣量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅曲菌桔霉素基因測(cè)定結(jié)果

根據(jù)1.2.3的方法,以橙色紅曲菌桔霉素基因簇序列為參照,設(shè)計(jì)6對(duì)PCR擴(kuò)增引物,以25株紅曲菌菌株基因組為模板,分析這些菌株基因組中是否含本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的針對(duì)桔霉素合成的關(guān)鍵基因片段。電泳結(jié)果如圖1(A～F)所示,2、3、7、9、15、16、17、18、19、20、22、23、25號(hào)菌株含有6對(duì)桔霉素合成相關(guān)基因片段的條帶,與Marker對(duì)照,條帶大小符合預(yù)期;1、4、5、6、8、10、11、12、14、21、24號(hào)菌株不含這些基因片段;13號(hào)菌株含有ctnA、pksCT、ctnR+pksCT基因片段,推測(cè)可能是ctnR反向引物未能與DNA模板結(jié)合,ctnR正向引物可以與DNA模板很好結(jié)合,并與pksCT反向引物一起擴(kuò)增出ctnR+pksCT基因片段。

圖1 25種紅曲菌的6對(duì)引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of 25 Monascus strains with 6 pairs of primers注:1～25分別為ZH3、MG3、ZH5、MY2、GW7、GW6、JC2、MY3、MG1、JC1、MY1、MS3、GW4、MS1、MF3、ZH4、GW2、 MS2、MG2、MF2、GW1、GW3、ZH2、GW5、ZH1;A、B、C、D Marker:Trans 2K plus Marker;E、F Marker:Trans 15K Marker。

2.2 桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了測(cè)定紅曲中桔霉素的含量,以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得峰面積對(duì)相應(yīng)桔霉素質(zhì)量濃度做線性回歸方程為y=1350.5x+6196.1,決定系數(shù)為R2=0.9921,檢測(cè)線性范圍在 50～1000 ng/mL。該方法檢測(cè)桔霉素的儀器檢出限為15.92 μg/kg[22]。

2.3 紅曲米中桔霉素含量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)1.2.4方法,采用UPLC測(cè)定25株紅曲菌株發(fā)酵紅曲米中桔霉素的峰面積。根據(jù)2.2中桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線以及1.2.5中的計(jì)算方法計(jì)算紅曲樣品中桔霉素含量。檢測(cè)及計(jì)算結(jié)果如表5所示。2、3、7、9、15、16、17、18、19、20、22、23、25有桔霉素檢出;1、4、5、6、8、10、11、12、13、14、21、24未檢出桔霉素。

表5 25株紅曲菌發(fā)酵紅曲中桔霉素的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Citrinin content of Hongqu fermented from 25 Monascus strains

2.4 桔霉素合成的關(guān)鍵基因和發(fā)酵紅曲中是否產(chǎn)生桔霉素的一致性分析

以桔霉素合成的關(guān)鍵基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),擴(kuò)增的結(jié)果與UPLC檢測(cè)菌株發(fā)酵紅曲中桔霉素的結(jié)果進(jìn)行一致性分析,具體見表6。由表6結(jié)果可見,合成桔霉素關(guān)鍵基因的PCR擴(kuò)增為陽性的菌株,UPLC檢測(cè)其紅曲中桔霉素的含量均超過功能紅曲中桔霉素含量不得高于50 μg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)(QB/T 2847-2007),而PCR結(jié)果中沒有擴(kuò)增到或沒有完全擴(kuò)增到文中設(shè)計(jì)的桔霉素合成關(guān)鍵基因片段的,桔霉素含量均低于儀器檢出限15.92 μg/kg,

表6 PCR擴(kuò)增與UPLC檢測(cè)結(jié)果的一致性分析Table 6 Consistency analysis between PCR amplification and UPLC detection results

續(xù)表

遠(yuǎn)低于QB/T 2847-2007功能性紅曲米(粉)的桔霉素限量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，菌株是否含有合成桔霉素關(guān)鍵基因與其發(fā)酵紅曲中桔霉素含量是否超標(biāo)具有一致性。

3 結(jié)論

不同來源的25株紅曲菌,以其桔霉素合成的關(guān)鍵基因?yàn)榘袠?biāo),設(shè)計(jì)6對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增的結(jié)果與UPLC檢測(cè)菌株發(fā)酵紅曲中桔霉素的結(jié)果進(jìn)行一致性分析,探討二者之間的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)表明，PCR擴(kuò)增結(jié)果與UPLC檢測(cè)結(jié)果具有一致性,即菌株是否含有合成桔霉素關(guān)鍵基因與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝下生產(chǎn)的紅曲中桔霉素含量是否超標(biāo)具有一致性。因此,可以采用本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的PCR方法作為判斷傳統(tǒng)發(fā)酵工藝條件下紅曲產(chǎn)品中桔霉素含量是否超標(biāo)的方法,該方法簡(jiǎn)單、快速,大大節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本;同時(shí),也為了解不同紅曲菌株分泌桔霉素的能力提供了基本信息。