實時熒光PCR定量測定肉制品中 羊源性成分

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(1.河南檢驗檢疫鑒定咨詢中心,河南鄭州 450003; 2.河南出入境檢驗檢疫局,河南鄭州 450003)

肉制品摻假是食品市場中的重要問題,而目前利用摻雜使假、以次充好等手段制造的“假羊肉”事件屢屢出現(xiàn),極大地侵犯了消費者的合法權益[1-2],因此建立準確、快速、有效的羊源性成分檢測方法是必要的。

運用PCR和實時熒光PCR方法檢測肉制品中的動物源性成分已經(jīng)得到了較多的關注和研究[3]。田金輝等[4]運用T-RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)可以快速鑒定生鮮肉中羊源性成分。王穎等[5]運用熒光定量PCR方法檢測畜肉食品中豬源性成分,靈敏度為0.1 μg/kg。

標準《SN/T 2051-2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法》[6]以試劑盒(大連TaKa-Ra公司)形式推出,引物及探針序列均不公布,不利于標準使用和推廣。目前的國家標準、行業(yè)標準或是文獻報道中,使用的檢測方法多是定性檢測方法[7-9],這些方法不能對部分摻假的肉類食品進行定量分析,因此需要建立準確性高、操作性強且易于推廣的定量檢測方法以滿足市場需求[10]。

本研究針對羊源及脊椎動物通用引物和探針,并將其克隆到PMD-18-T載體,制備羊源和肉類通用基因的重組質(zhì)粒以構建標準曲線,通過測定樣品中羊源Ct值和肉類通用基因Ct值求得各自拷貝數(shù),以拷貝數(shù)的比值為參照,進而判斷肉制品是否故意摻假并衡量其摻假程度,為質(zhì)檢部門打擊不法商販、維護消費者權益提供有力的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉等肉樣、羊肉卷、精品小肥羊、自然羊肉、羊腿等肉制品 鄭州市農(nóng)貿(mào)市場或大型超市;蛋白酶K(20 mg/mL) TAKARA公司;組織裂解液:1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、10%十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、氯仿/異戊醇(24∶1)、3 mol/L醋酸鈉 均為自配試劑;瓊脂糖、LB培養(yǎng)基 生工生物工程(上海)股份有限公司;Tris-飽和酚、Godview染色劑、氨芐青霉素 北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇、異丙醇、醋酸鈉 均為國產(chǎn)分析純;DNA Marker、Premix Ex 2×TaqTM(Probe qPCR)、pMD-18-T載體、工程菌DH5α感受態(tài)細胞、質(zhì)粒銷量制備試劑盒、瓊脂糖凝膠快速回收DNA試劑盒 大連寶生物公司。

DT500電子天平 江蘇常熟長青儀器廠;Lightcycle 1.5熒光定量PCR儀(Roche) 上海恒久醫(yī)療器械有限公司;Hermle Z36HK高速冷凍離心 HERMLE科技儀器有限公司;GRINDOMIX GM200組織勻漿機 萊馳有限公司;BioSpec-nano微量核酸蛋白儀 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;LabCycler Standard Plus梯度PCR儀 德國Senso公司;Thermo MaxQ4000恒溫搖床 鄭州普瑞斯科貿(mào)有限公司;INE5000恒溫培養(yǎng)箱 美國Memmert公司;GBOX-HR-E-M凝膠成像系統(tǒng) 基因有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉樣制備 取新鮮肉樣的肌肉組織,剔除肌腱、脂肪,于勻漿機(8000 r/min)中勻漿10 s,勻質(zhì)過程中不同肉類要分開處理,以防止不同來源的動物組織交叉污染。

1.2.2 DNA提取 采用酚/氯仿法提取肉樣基因組DNA[11-12]。向樣品中加入700 μL組織裂解液和20 μL蛋白酶K(20 mg/mL),上下顛倒混勻，于65 ℃水浴30 min,12000 r/min離心10 min后,取上清液400 μL用于酚氯仿核酸提取,最后加入100 μL滅菌的ddH2O溶解核酸,DNA含量用核酸蛋白儀測定,保證DNA的OD260/OD280比值在1.7～1.9之間。

1.2.3 羊源性熒光定量引物和探針 羊的引物和探針序列參照文獻[13]進行設計,通用引物和探針的序列是根據(jù)脊椎動物線粒體DNA(16S rDNA)上的保守序列進行設計的,引物和探針均由寶生物工程(上海)公司合成,序列見表1。

表1 引物和探針的序列Table 1 Primer and probe sequences

1.2.4重組質(zhì)粒的構建 PCR反應體系:2×Taq PCR Master Mix 25 μL,上下游引物(10 μmol/L)各2 μL,模板1 μL,用水補齊至50 μL。PCR反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個循環(huán);72 ℃10 min。PCR反應結束后,取產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳。

PCR產(chǎn)物按照試劑盒說明書進行膠回收,將其連接到pMD-18-T載體上,轉化DH5α感受態(tài)細胞做酶切鑒定,PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒,由生工進行測序,并命名為pMD-18-T-ovine,pMD-18-T-universal標準質(zhì)粒。

1.2.5 熒光定量PCR檢測方法的確定 反應體系為25 μL:2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5 μL,上下游引物0.5 μL(反應體系終濃度0.2 μmol/L),探針1 μL(反應體系終濃度0.4 μmol/L),DNA模板2 μL,其余不足用滅菌雙蒸水補齊。反應循環(huán)參數(shù)為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 45 s,40個循環(huán)。

1.2.6 熒光定量PCR標準曲線的建立 分別將pMD-18-T-ovine,pMD-18-T-universal標準質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋,采用熒光定量PCR進行擴增,以log(重組質(zhì)粒樣品稀釋度)為橫坐標,以對應的Ct值為縱坐標生成標準曲線,其中重組質(zhì)粒標準品的拷貝數(shù)按下式計算:

拷貝數(shù)=樣本濃度/樣本分子量×6.02×1014

式(1)

式中,樣本濃度為測定的質(zhì)粒含量(ng/μL),經(jīng)核酸蛋白檢測儀測定后,羊和通用重組質(zhì)粒的濃度分別為120.99和84.7 ng/μL;樣本分子量=重組質(zhì)粒長度×660。

重組質(zhì)粒長度=T載體長度+目的片段長度

式(2)

式中,T載體長度為2692 bp。

1.2.7 相對定量檢測體系的建立 同一份肉樣的DNA分別用羊源和通用引物探針體系進行檢測,測得Ct值后通過標準曲線計算出各自的拷貝數(shù),根據(jù)拷貝數(shù)的比值計算樣品中羊肉源成分占總肉成分的百分比含量,其換算公式為:

X(%)=10(Cts-C1)/k1-(Ctu-C2)/k2×100

其中,X,待檢樣品羊源成分占總肉成分的百分比含量(%);Cts,待檢樣品羊源成分引物體系PCR Ct值;Ctu,待檢樣品通用引物體系PCR Ct值;C1,羊源成分標準曲線截距;C2,通用標準曲線截距;k1,羊源成分標準曲線斜率;k2,通用標準曲線斜率。

1.2.8 羊源性成分熒光定量PCR檢測方法的評價

1.2.8.1 靈敏度的測定 調(diào)整羊源DNA模板的初始濃度為200 ng/μL,用滅菌雙蒸水進行10倍梯度稀釋,以100開始,共設置100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-67個稀釋度,然后分別取2 μL各稀釋度的稀釋液為模板,進行熒光PCR,檢測引物探針的靈敏度。每個梯度重復3次。

1.2.8.2 特異性的測定 以豬、牛、雞、羊、鴨等常見畜禽肉提取的DNA作為模板,進行實時熒光PCR反應,以驗證羊源引物和探針體系的特異性。

1.2.9 制作模擬加工樣品檢測定量體系 針對檢測體系,按照表2制備模擬樣品,將羊肉樣含量在90%、50%和10%時與其他單一物種進行兩兩混合以及多物種混合,制備各自不同模擬混合樣品,提取DNA后進行定量檢測。

表2 羊模擬混合肉樣(w/w)Table 2 Samples of ovine mixture(w/w)

1.2.10 市售樣品的檢測 采用建立的羊源及通用引物探針體系對購自市場的各種肉制品樣品進行檢測,驗證所建立的熒光定量PCR方法的適用性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次試驗結果重復兩次,所有結果采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析,利用Excel進行圖表編輯,采用FAO方法規(guī)定了統(tǒng)一的檢測數(shù)據(jù)評價標準,即RSD≤25%。

2 結果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

pMD-18-T-ovine,pMD-18-T-universal標準質(zhì)粒的PCR鑒定結果顯示羊源及通用重組質(zhì)粒皆獲得有效擴增(圖1所示),證實各羊源和通用檢測目的片段已經(jīng)成功重組到質(zhì)粒中。

圖1 羊源及通用重組質(zhì)粒PCR鑒定結果Fig.1 PCR detections of ovine and meat universal recombinant plasmids 注:M:DL2000 bp Marker;1～2:羊源引物擴增目的片段; 3～4:通用引物擴增目的片段。

2.2 重組質(zhì)粒的測序結果

將初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序。測定的序列與Genbank已知的序列進行Meglign比對,結果顯示測定的基因片段序列均正確。測序結果如下:

羊重組質(zhì)粒測序結果:

GCTAGAGGCAGTGCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGAACTGTAGCCTTCTGACTCGCTCTGTTTGGCTGCCTTTCCTTCCCCGCCAGTCTCAATGGTTTTTGAGGGTTTAAAGGCATGTTGGAAT

通用重組質(zhì)粒測序結果:

AGTAGAGGCAGTGCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGATAGAAACCGACCTGGATTACTCCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGACTTTAATCGTTGAACAAACGAACCTTTGATAGCGGTTGCACCATCGGGGTGTCCTGATCCAACATCGAGGTCGTAAT

2.3 羊源及通用重組質(zhì)粒標準曲線的建立

根據(jù)式(1)～式(2)得出羊和通用重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)分別為:4.02×1010、2.82×1010copy/μL。將重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋得到101～1010濃度樣品,進行實時熒光PCR擴增,結果表明所建立的質(zhì)粒標準品靈敏度可低至數(shù)量級為101拷貝數(shù)。

以log(重組質(zhì)粒樣品稀釋度)為橫坐標,以對應的Ct值為縱坐標生成標準曲線,具體結果分別是Y羊=-3.048x+40.67和Y通用=-3.309x+42.13,且羊和通用質(zhì)粒所建立的標準曲線的相關系數(shù)分別為0.9989、0.9994,表明其直線性好,可用于準確定量。

2.4 羊源性成分熒光定量PCR檢測方法的評價

2.4.1 羊源性成分熒光定量PCR檢測方法的靈敏度 取10倍梯度稀釋的肉源DNA各2 μL為模板,進行實時熒光PCR檢測,結果如圖2所示,羊源引物和探針靈敏度良好,其檢測限Ct值范圍控制在20～36循環(huán)之間,最低檢測到羊的DNA含量為0.02 ng/μL。

圖2 羊源引物探針體系靈敏度檢測Fig.2 Sensitivity of ovine primer-probe system

2.4.2 羊源性成分熒光定量PCR檢測方法的特異性 特異性結果顯示，只有羊肉有熒光信號,其他肉樣均無擴增(圖3),表明所建立的方法特異性較好。

圖3 羊源引物探針體系特異性檢測Fig.3 Specificity of ovine primer-probe system

2.5 模擬加工樣品定量檢測

根據(jù)定量體系換算公式計算模擬加工樣品中目的種源成分的含量,結果見表3。由表3可知，對于不同的混合樣品,經(jīng)統(tǒng)計學分析處理后,摻入量分別為90%、50%、10%的兩兩混合及多物種混合樣品經(jīng)標準曲線定量體系檢測后所得的比例含量值為97.55%、58.28%、20.94%;摻入量為10%的樣品測定值和真實值含量有一定偏差,相對標準偏差為49.96%,大于25%,這可能與制作模擬混合樣品稱量過程中的人為誤差以及樣品摻入量低有一定關系,而90%、50%時所得結果相對準確,也表明樣品含量高時有助于定量檢測的準確性,證實所建立的標準曲線定量檢測體系可以應用于羊肉制品的檢測。

表3 羊模擬混合肉類樣品檢測結果(%)Table 3 Results of quantitative detections of ovine mixture(%)

2.6 市售樣品的檢測

市售樣品檢測結果如表4所示,7份羊肉樣品中有6份檢出有羊源成分,其中1份羊肉卷未檢出羊源成分。運用定量檢測體系對其含量進行了相對的定量,發(fā)現(xiàn)熟羊肉和羊腿等樣品的羊源性成分均在95%以上。對羊肉卷的檢測發(fā)現(xiàn),羊肉含量占16.75%,明顯低于其包裝上標明的羊肉含量54%。羊肉串樣品測得的羊源成分僅為34.45%,這些結果表明市售肉制品存在摻假現(xiàn)象,同時證明本研究建立的方法可以應用于市售樣品的初步定量,為衡量肉制品的摻雜提供依據(jù)。

表4 市售樣品的定量分析Table 4 Quantitative detections of commercial samples

3 結論與討論

肉制品摻假是食品市場中的重要問題,涉及畜牧業(yè)的健康發(fā)展、消費者權益的保障、進出口貿(mào)易等諸多領域。目前國內(nèi)肉源成分PCR方法主要著眼于定性檢測,但是尚不能對部分摻假的肉類食品進行定量分析,熒光定量檢測多為轉基因成分檢測[14]、病毒[15]、細菌[16]等。苗麗等[17-18]運用微滴數(shù)字PCR方法根據(jù)肉樣的質(zhì)量與DNA含量的關系,以及DNA含量與拷貝數(shù)之間的關系,建立了測定肉制品的定量方法,得到了較好的效果。Cai等[19]也是運用此方法確定了豬源和雞源性成分定量檢測方法,但是數(shù)字PCR儀器昂貴,不能夠較快普及市場。而部分研究僅僅是通過已知濃度系列DNA樣品建立標準曲線,進而計算樣品中目的DNA的含量,但是無法得知肉的具體質(zhì)量百分比,對于市售樣品檢測的指導作用較小[7,20];沙才華等[21]通過模擬濃度標準曲線,完成了對牛源性成分的相對定量檢測。Fajardo等[22]以目的肉源不同含量百分比與Ct值構成線性關系,建立馬和鹿源成分的定量檢測方法,取得較好的檢測結果,而對于加工肉制品方面缺乏一定的研究數(shù)據(jù)。Brodamn等[23]所建立的方法與本研究較為相似,然而其僅僅是通過比較量體系的Ct值差異作為含量百分比的差異,與本研究所用的通過拷貝數(shù)之間的比值作為含量百分比是兩個不同的思路。

線粒體DNA由于豐度高且在不同組織部位的含量不一致,容易導致定量結果偏差較大;而基因組DNA含量較恒定,適合用于動物源性成分的定量檢測[24-25]。本研究選擇單拷貝基因設計特異性引物和探針,在定量檢測時更能準確地計算其拷貝數(shù),為肉源成分定量檢測研究提供方法借鑒。

本研究建立的PCR方法,特異性強,靈敏度高。利用建立的相對定量檢測體系,摻入量分別為90%、50%、10%的兩兩混合及多物種混合樣品經(jīng)標準曲線定量體系檢測后所得的比例含量均值為97.55%、58.28%、20.94%。摻入量為10%的樣品測定值和真實值含量有一定偏差,這可能與制作模擬混合樣品稱量過程中的人為誤差以及樣品摻入量低有一定關系,而90%、50%時所得結果相對準確,在摻有相同比例羊肉的不同種類混合樣品中組間差異不顯著,也表明樣品含量稍高時有助于定量檢測的準確性,對于含量較低的摻假食品可以通過多次重復實驗以減少誤差。

市售樣品的檢測表明，該定量檢測方法可以對生鮮肉、熟肉制品以及加工的肉制品進行定量檢測,可滿足市場中肉制品摻假制假檢測需求,為肉制品日常檢測及是否摻假提供有力的科學依據(jù)。