棠梨籽油的超聲波-微波協(xié)同提取及其脂肪酸組成

蔣新龍 蔣益花 陳思晴 沈 瑾 張洋彪 周佳文

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

棠梨(PyrusbetulaefoliaBunge)屬薔薇科(Rosaceae)梨屬(PyrusL.)喬木，又稱杜梨、豆梨。棠梨原產(chǎn)我國，廣泛分布在我國的北部、東北部和中部各省，儲量豐富。棠梨為梨屬較為原始類型，其綜合利用價值較高，集嫁接繁殖砧木、材用、藥用和園林綠化于一身[1]。關(guān)于棠梨的研究主要集中在種子萌發(fā)與幼苗生長的研究、幼苗根系生長狀況的研究以及作為砧木嫁接梨樹等方面[2]。棠梨果實未成熟時很澀，無法食用，完全成熟后全果為黑色，鮮食口感香甜；另外成熟棠梨果實中礦物元素含量普遍較高，特別是 P、K、Ca、Mn、Mg 含量較多[3]，可以被開發(fā)生產(chǎn)野生棠梨果露酒[3]及棠梨果醋[4]。棠梨籽是棠梨在果品加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，目前基本廢棄。目前對于棠梨籽油的提取及脂肪酸組成分析的研究鮮見相關(guān)報道。本實驗在單因素實驗基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面法研究超聲波-微波協(xié)同提取棠梨籽油的最優(yōu)工藝參數(shù)，通過GC分析其脂肪酸組成及含量，以期為棠梨籽油的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棠梨籽市售，選取顆粒飽滿，無霉?fàn)€變質(zhì)的為試材。37種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma Aldrich)；所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

FW80高速萬能粉碎機；格蘭仕微波爐D80D20EP-A3型(中火對應(yīng)60%，功率480 W)；KQ5200DE超聲波清洗機；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；101A-3B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；Agilent 7890A氣相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 超聲波-微波協(xié)同提取

超聲波提取法利用超聲波空化作用伴隨的熱效應(yīng)和機械效應(yīng)，加速溶劑萃取過程，但超聲波提取技術(shù)無法完全破壞細(xì)胞壁的束縛[5]。微波萃取根據(jù)不同物質(zhì)吸收微波能力的不同，呈現(xiàn)出選擇性加熱特點[6]。極性越大，對微波能的吸收越大，升溫越快，越有利于細(xì)胞壁的完全破裂，提取速度也就越快[6-7]。理論上，用先超聲波提取技術(shù)進行提取，可使細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)疏松，將細(xì)胞中極性成分釋放出來，再用微波提取技術(shù)，使棠梨籽細(xì)胞完全破壁，將明顯提高提取效果。本研究根據(jù)理論預(yù)測進行預(yù)實驗，先微波后超聲、先微波后超聲再微波、先超聲后微波這3種方案，發(fā)現(xiàn)先超聲后微波這種方案提取效果比較好，與原先預(yù)測一致。

具體流程：棠梨籽→除雜→烘干→粉碎→過篩→稱重→加入石油醚→超聲波輔助提取→微波輔助提取→抽濾→濃縮→棠梨籽油。

將3.000 0 g粉碎成40目的的棠梨籽粉裝入燒瓶中，按一定料液比加入石油醚，于一定條件下先進行超聲輔助提取，再調(diào)節(jié)微波功率繼續(xù)進行微波輻射提取，結(jié)束后進行減壓抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾濃縮得到提取物，將提取物放恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥，直至恒重，每組實驗重復(fù)3次，取平均值。按公式計算棠梨籽油的出油率Y。

式中：m為棠梨籽質(zhì)量/g；m1為空瓶質(zhì)量/g；m2為空瓶和棠梨籽油的質(zhì)量/g。

1.2.2 提取優(yōu)化實驗

單因素實驗：超聲提取時間固定10 min[8-9]，采用1.2.1的提取操作方法，提取條件為：液料比4 mL·g-1，超聲功率160 W，超聲提取10 min，再放入微波爐中，在中火功率下加熱40 s，考察超聲溫度為(30、40、50、60、70 ℃)對出油率的影響；液料比4 mL·g-1，超聲50 ℃以功率160 W提取10 min，再放入微波爐中，在中火功率下，考察微波時間(20、30、40、50、60 s)對出油率的影響；液料比6 mL·g-1，超聲50 ℃，超聲時間10 min，再放入微波爐中，在中火功率下，加熱40 s，考察超聲功率(120、140、160、180、200 W)對出油率的影響；超聲50 ℃，超聲時間10 min超聲功率為160 W，再放入微波爐中，在中火功率下，加熱40 s，考察料液比(2、3、4、5、6 mL·g-1)對出油率的影響。

響應(yīng)面優(yōu)化實驗：根據(jù)微波時間、超聲功率、料液比、超聲溫度4個單因素平行實驗的結(jié)果，采用響應(yīng)面分析，以出油率為響應(yīng)值，對這四因子在三水平進行優(yōu)選。表1為響應(yīng)面實驗因素水平表。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計實驗因素與水平

1.2.3 棠梨籽油理化性質(zhì)測定

酸價測定采用GB/T 5530—2005法；過氧化值測定采用GB/T 5538—2005法；碘值測定采用GB/T 5532—2008法；皂化值采用GB/T 5534—2008法；密度測定采用GB/T 5526—1985法；折光率測定采用GB/T 5527—2008法。平行3次，取平均值。

1.2.4 棠梨籽油的GC成分分析

脂肪酸組成測定參照 GB/T 5009.168—2016的內(nèi)標(biāo)法氣相色譜分析。

色譜條件：色譜柱：CNW CD-2560(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；進樣口溫度：250 ℃；檢測器類型：FID；檢測器溫度：260 ℃；進樣量：1 μL；分流比：10∶1；載氣流速：0.5 mL/min；升溫程序：130 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升溫至240 ℃，在240 ℃保持30 min。

1.3 統(tǒng)計方法及分析軟件

指標(biāo)均重復(fù)測定3次并取平均值，利用Origin8軟件作圖；應(yīng)用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并用Duncan多重比較(SSR法)檢驗各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

超聲溫度的影響：溫度不僅影響溶劑和油脂的分子熱運動，同時溫度過高會造成石油醚揮發(fā)，還會引起油脂分子結(jié)構(gòu)的改變。由圖1可知，隨著超聲溫度的升高，棠梨籽出油率逐漸增大，在60 ℃時出油率達到最大值。在較低的溫度時，提高溫度使分子運動加劇，溶劑和油脂的黏度同時降低，使出油率增大；當(dāng)溫度接近石油醚的沸點時，石油醚揮發(fā)加快，減少了石油醚與棠梨籽粉的有效接觸面積，另外溫度升高還使棠梨籽油脂分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使出油率下降。因此60 ℃為較理想的提取溫度。

微波時間的影響：由圖1可知，隨著微波時間的延長，棠梨籽出油率逐漸增大，在40 s時出油率達到最大值。出油率上升較快的原因可能是隨著微波時間延長，微波輻射在短時間內(nèi)對細(xì)胞壁的破碎作用較大，加速了被萃取出的籽油向棠梨籽表面的擴散速度。但當(dāng)溶解度達到飽和時，油脂溶出減少，出油率不再明顯提高[10]。因此，本實驗較適微波時間為40 s。

超聲功率的影響：超聲波功率越大，其產(chǎn)生的機械作用和空化作用越劇烈，油脂滲透出來的速度就越快[11]。當(dāng)超聲功率太大時，超聲波的傳播出現(xiàn)衰減，導(dǎo)致出油率增加緩慢甚至下降[12]。由圖1可知，超聲波功率160 W較為適宜。

液料比的影響：有效濃度差是超聲波-微波協(xié)同法提取油脂的主要推動力。石油醚用量的增加相當(dāng)于降低了油的濃度，增加了石油醚與棠梨籽細(xì)胞中油脂的濃度差，油料細(xì)胞內(nèi)外滲透壓越大，增加了傳質(zhì)推動力，從而提高了油脂在石油醚中的擴散速度，油脂越容易浸出[13]。當(dāng)石油醚增大到一定程度后出油率反而降低，主要原因可能是棠梨籽中油脂含量逐漸減少，滲透壓的改變對棠梨籽油的提取不再起較大作用，再增加溶劑用量反而起到稀釋作用[14]；另外溶劑體積過多，提取溶劑對微波能的吸收增加，導(dǎo)致細(xì)胞對微波能吸收減少，細(xì)胞壁破裂不完全，油脂不能從細(xì)胞中充分溶出[15-16]。當(dāng)然溶劑體積過多還會造成溶劑和能源的浪費，并給后續(xù)的濃縮工作帶來困難。由圖1可知，液料比4 mL/g較為適宜。

圖1 不同處理對棠梨籽油出油率的影響

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果與分析

響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果見表2。采用Designexpert軟件對所得表2實驗數(shù)據(jù)進行多項擬合回歸，得到棠梨籽出油率對超聲溫度(A)、微波時間(B)、超聲功率(C)、液料比(D)的二次多項回歸模型方程：

Y=+34.07+1.73A+0.2B+0.10C+0.68D-0.17AB-0.45AC-0.23AD+0.4BC-0.11BD-0.35CD-1.08A2-0.91B2-0.78C2-1.27D2

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型方程方差分析

注：* 表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2.2 雙因素交互作用分析

在超聲溫度、液料比、超聲功率、微波時間4個因素中任取2個作為X和Y，以出油率作為Z，由Design-Expert.V8.0軟件處理作出相應(yīng)的各因素交互作用的三維曲面圖。表現(xiàn)為曲線越陡，說明交互作用對棠梨籽油出油率的影響越顯著。三維曲面圖分析可知，棠梨籽油出油率隨任意2個變量的增加都呈現(xiàn)上升趨勢，達到某一極大值后，曲面下降或趨向于平緩，且A(超聲溫度)與C(超聲功率)的交互作用對棠梨籽油出油率影響最顯著，這與回歸分析的結(jié)果吻合。

2.2.3 提取工藝優(yōu)化及驗證

利用軟件預(yù)測模型的極大值，并得出提取棠梨籽油的最優(yōu)條件為：超聲溫度(70.00 ℃)、微波時間(39.22 s)、超聲功率(142.79 W)和液料比(4.57 mL·g-1)，在此優(yōu)化條件下預(yù)測棠梨籽油出油率最大值為34.80%。結(jié)合生產(chǎn)實際的可操作性，將響應(yīng)面優(yōu)化分析所得到的各因素理論最優(yōu)值修正為：超聲溫度為70.00 ℃、組合時間為超聲10 min-微波40.00 s、組合功率為超聲140 W-微波480 W、液料比為4.57 mL·g-1。在修正條件下進行驗證實驗，棠梨籽油出油率均達到34.78%以上，與預(yù)測值基本相符，驗證了模型的有效性，可用于超聲波-微波協(xié)同提取棠梨籽油工藝條件的優(yōu)化和預(yù)測。

2.3 棠梨籽油主要理化指標(biāo)測定

由表4知，棠梨籽油的過氧化值為5.02 mmol/kg，過氧化值是衡量油脂被氧化的程度，數(shù)值越高，油品越差，棠梨籽油的過氧化值低于食用植物油國家標(biāo)準(zhǔn)。棠梨籽油的酸值為 2.74 mgKOH/g，低于3.00 mgKOH/g，符合食用植物油國家標(biāo)準(zhǔn)。碘值是判斷油脂脂肪酸不飽和程度的指標(biāo)，碘值越高，不飽和脂肪酸含量越高，棠梨籽油的碘值為 117.22 gI/100 g，屬于半干性油。皂化值表示油脂中脂肪酸相對分子質(zhì)量的大小，皂化值越大，脂肪酸的相對分子質(zhì)量越小，棠梨籽油的皂化值為 163.75 mgKOH/g。此外，棠梨籽油相對密度為 0.882 6、所制棠梨籽油為澄清透明的淺黃色液體。因此，以測定的理化指標(biāo)判斷，棠梨籽油達到食用植物油國家標(biāo)準(zhǔn)。

表4 棠梨籽油的主要理化性質(zhì)

注：GB /T 2716—2005標(biāo)準(zhǔn)要求酸值/mgKOH/g ≤3；過氧化值/g/100≤0.25，1 mmol/kg=39.4 g/100 g。

2.4 棠梨籽油脂肪酸組成分析

根據(jù)1.2.4方法，對棠梨籽油進行GC分析，棠梨籽油的脂肪酸組成分析結(jié)果見表5和圖2。張鈺斌[19]研究表明，加熱溫度為150 ℃時順反異構(gòu)化開始轉(zhuǎn)化反應(yīng)，油酸樣品中開始有反式油酸生成。所以表5棠梨籽油的第6個組分是反油酸，應(yīng)該是由GC分析預(yù)處理過程中油酸轉(zhuǎn)變成的反油酸，該組分實際為油酸，這與鄭聯(lián)合等[20]的研究結(jié)果一致。由表5可知，從棠梨籽油中共鑒定出15種脂肪酸，主要脂肪酸為反油酸(24.29%)、亞油酸(60.94%)、順-10-十五烯酸(7.69%)、花生酸(1.40%)、硬脂酸(2.21%)，5種主要脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)占96.53%。其中不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.84%，尤其以不飽和脂肪酸亞油酸為主，高于一般植物油中亞油酸的含量，如油茶油7.08%、菜籽油23.57%、花生油31.36%、芝麻油42.75%[21]。亞油酸是人體必需脂肪酸，具有營養(yǎng)保健和藥療功效[22]，可作為高血脂、冠狀動脈粥樣硬化、心血管病人的長期食療保健油品，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

表5 棠梨籽油脂肪酸種類及其相對含量

圖2 棠梨籽油脂組份分析色譜圖

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面方法，確定了超聲波-微波協(xié)同提取法的最佳提取工藝：將40目的棠梨籽粉按3.45 mL·g-1料液比加入石油醚，超聲溫度70.00 ℃、超聲功率120 W、超聲輔助提取10 min，再調(diào)節(jié)微波功率480 W微波輻射提取30.00 s。此條件下, 出油率為 34.78%。響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠，可用于超聲提取棠梨籽油工藝條件的優(yōu)化。

以測定的理化指標(biāo)判斷，所提取的棠梨籽油達到了食用植物油國家標(biāo)準(zhǔn)。GC分析得到棠梨籽油主要成分有油酸、亞油酸、順-10-十五烯酸、硬脂酸、花生酸，尤其以不飽和脂肪酸亞油酸為主。棠梨籽油可作為優(yōu)質(zhì)食用油源和功能性食用油開發(fā)利用。