芝麻抗氧化肽分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定的研究

蘆 鑫 李若昀 張麗霞 高錦鴻 孫 強(qiáng) 宋國(guó)輝 黃紀(jì)念

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心1，鄭州 450002)( 河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心2，鄭州 450002) (河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院3，鄭州 451450) (河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所4，鄭州 450002)

芝麻是世界重要油料作物之一，2014年全球芝麻產(chǎn)量623萬(wàn)t。我國(guó)是芝麻生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó)，年均消費(fèi)芝麻在100萬(wàn)t以上[1]。我國(guó)芝麻主要用于榨油，榨油后的副產(chǎn)品芝麻餅粕的蛋白質(zhì)含量能達(dá)到50%左右，研究表明，芝麻蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)資源，但受加工技術(shù)所限，通常作飼料或肥料，使芝麻蛋白質(zhì)資源未得到充分利用[2-4]。將蛋白通過(guò)酶解轉(zhuǎn)化為具有功能性肽類(lèi)是深加工的常用方式，研究表明，芝麻蛋白通過(guò)酶解可以產(chǎn)生抗氧化肽[5-7]。

目前，前人對(duì)芝麻抗氧化肽的研究主要集中在制備與活性檢測(cè)，對(duì)芝麻抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定、結(jié)構(gòu)組成研究較少[8]。多肽結(jié)構(gòu)與抗氧化活性有密切關(guān)系，多肽的結(jié)構(gòu)鑒定是揭示構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)，也是指導(dǎo)后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ)[9-10]。本研究采用胰蛋白酶水解芝麻蛋白制備抗氧化肽，酶解液采用納濾脫鹽、超濾初步分離純化，然后采用制備液相進(jìn)行純化，隨后采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀獲取多肽序列，合成上述多肽，驗(yàn)證抗氧化活性，為芝麻蛋白的資源開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻蛋白：實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法參照袁東振[11]，芝麻蛋白溶液采用截留分子質(zhì)量為5 000 u透析膜透析，凍干，獲得芝麻蛋白，芝麻蛋白濃度為(92.17±0.31)%。

多肽VALVTGGDSGIGR、DVANEANQLDLK、ELFFGAGGENPESFFK、QDNANNA- NQLDPNPR、ENIEHTAATHSYNPR：上海吉爾生物公司合成；胰蛋白酶：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)、2, 2′-聯(lián)氮雙( 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽自由基(ABTS)、2, 4, 6-三硝基苯磺酸( TBNS)、2, 4, 6-三吡啶基三嗪(TPTZ)： 美國(guó)sigma-aldrich公司；平膜RO4、NFM、UE003、UE005、UE008、UE010：中科瑞陽(yáng)膜技術(shù)有限公司；甲醇：色譜純，德國(guó)MERCK集團(tuán)；其他試劑：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LC-500型制備液相；Testcell C-70 平膜裝置；TGL20M-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)；UV-6300雙光束型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；DNM-9606酶標(biāo)分析儀等設(shè)備用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芝麻多肽的制備

取一定質(zhì)量芝麻蛋白加入0.06 mol/L pH8.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，配成質(zhì)量濃度5%的蛋白溶液，加酶量8 000 u/g蛋白加入胰蛋白酶，45 ℃反應(yīng)2 h，沸水浴10 min終止反應(yīng)，冷卻室溫。在此酶解條件下，酶解液的水解度為(17.54±0.17)%。采用3 mol/L HCL調(diào)節(jié)pH到7，10 000 r/min離心30 min，收集上清液(SPT)備用。

1.2.2 納濾脫鹽

將SPT裝入平膜裝置，采用NFM納濾膜脫鹽，操作壓力為5 MPa，攪拌速度400 r/min，透過(guò)液達(dá)到料液體積80%時(shí)，終止納濾，截留液補(bǔ)充蒸餾水到初始酶解液體積，進(jìn)行第二次納濾，納濾過(guò)程重復(fù)三次，截留液(SPTN)備用，測(cè)定脫鹽率與多肽回收率。

式中：Rs為脫鹽率；mrs和mfs為50 mL截留液和初始酶解液中灰分質(zhì)量/mg。

式中:Rp為多肽回收率；Crp和Cfp為截留液和初始酶解液中多肽濃度/mg/mL；Vr和Vf為截留液和原始酶解液體積/mL。

1.2.3 超濾分離酶解液

SPTN依次通過(guò)UE010(截留分子質(zhì)量10 ku)、UE008(截留分子質(zhì)量8 ku)、UE005(截留分子質(zhì)量5 ku)、UE003(截留分子質(zhì)量3 ku)進(jìn)行超濾，超濾條件為：溫度25 ℃，壓力3 MPa，轉(zhuǎn)速400 r/min，分成6個(gè)組分(<3 ku，3～5 ku，5～8 ku，8～10 ku，>10 ku，脫鹽料液)。測(cè)定各組分DPPH、ABTS的IC50和FRAP值。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考TORRES-FUENTES方法稍作修改，取酶解液100 μL加入于96孔酶標(biāo)板中，隨后加入100 μL 2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液，振蕩30 s，室溫避光反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度Ai，以同樣的方法同時(shí)測(cè)定100 μL酶解液與100 μL乙醇混合后的吸光度Aj，100 μL DPPH溶液與100 μL乙醇混合后的吸光度Ao[14]。DPPH自由基清除率(DI)計(jì)算公式：

調(diào)節(jié)酶解液濃度至0.01～10 mg/mL，測(cè)定DPPH自由基清除率，采用IBM SPSS24的probit回歸計(jì)算IC50，即DPPH清除率達(dá)到50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的濃度。

1.2.5 ABTS自由基清除能力測(cè)定

調(diào)節(jié)酶解液濃度至0.01～10 mg/mL，測(cè)定ABTS自由基清除率，采用IBM SPSS24的probit回歸計(jì)算IC50，即ABTS清除率達(dá)到50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的濃度。

1.2.6 FRAP測(cè)定

取50 μL 3 mg/mL 酶解液加入到96孔酶標(biāo)板中，隨后加入150 μL FRAP工作液(由pH 3.6，0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液，10 mmol/L TPTZ，20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1比例混合)，振蕩30 s，避光37 ℃反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)591 nm處測(cè)定吸光度。另以0～2 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[16]。

1.2.7 制備液相分離酶解液

將活性最高的組分，首先通過(guò)反滲析膜RO4進(jìn)行濃縮，濃縮至50 mg/mL，隨后采用0.45 μm針頭濾器過(guò)濾，以上樣量4 mL進(jìn)樣到制備液相。制備液相條件為：色譜柱Ultimate AQ-C18(250×20 mm，5 μm)，55%(V/V)甲醇溶液，其中含0.1%(V/V)三氟乙酸，流速8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，1 min/管收集流動(dòng)相，將各色譜峰對(duì)應(yīng)試管分別混合，測(cè)定各個(gè)色譜峰的DPPH、ABTS清除能力與FRAP值，確定最強(qiáng)活性的色譜峰。

1.2.8 高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀分析芝麻抗氧化肽序列

將高活性組分采用氮吹儀吹干，寄送到蘇州普泰公司，通過(guò)Nano-LC-ESI-MS/MS 分析多肽序列。色譜系統(tǒng)為安捷倫1100 高效液相系統(tǒng)，ESI-MS/MS為美國(guó)熱電 LTQ離子阱質(zhì)譜儀，色譜柱為T(mén)hermo Finnigan LTQ Linear Ion Trap。其中高效液相的流動(dòng)相A由2%(V/V)乙腈水溶液(含0.5%甲酸)，流動(dòng)相B是90%(V/V)乙腈水溶液(含0.5%甲酸)。測(cè)定時(shí)，流動(dòng)相B從初始組成2%在60 min內(nèi)增加到90%，隨后維持40 min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用ProtTech’s ProtQuest (Norristown, PA, USA)軟件分析。

1.2.9 多肽抗氧化性驗(yàn)證

合成VALVTGGDSGIGR、DVANEANQLDLK、ELFFGAGGENPESFFK、QDNANN- ANQLDPNPR、ENIEHTAATHSYNPR 5種多肽，將多肽粉分別加入蒸餾水，配成濃度為0.01～5 mg的溶液，測(cè)定DPPH和ABTS清除率的IC50,以及FRAP，具體方法見(jiàn)1.2.4，1.2.5，1.2.6。

1.2.10 常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

芝麻餅粕中蛋白含量測(cè)定采用凱氏定氮(GB 5009.5—2016)，轉(zhuǎn)換系數(shù)5.30；多肽濃度測(cè)定采用三氯乙酸可溶性氮法[12-13]；水解度測(cè)定采用TNBS法[13]；酶解液灰分測(cè)定采用550 ℃灰化法(GB 5009.4—2016)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.3進(jìn)行單因素方差分析，0.05水平為顯著，0.01為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻蛋白酶解液納濾脫鹽

納濾是膜孔徑1～10 nm的壓力驅(qū)動(dòng)膜，分離范圍介于超濾與反滲析之間，對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量小于200 u的單價(jià)離子與有機(jī)小分子截留能力差，小分子會(huì)透過(guò)納濾膜進(jìn)入透過(guò)液，而大分子保留在截留液中[17]。芝麻蛋白酶解液的納濾脫鹽見(jiàn)表1，由表1可知，隨著納濾次數(shù)從1次增加到3次，SPT中的鹽分基本除去，為后續(xù)芝麻抗氧化肽的分離純化奠定有利基礎(chǔ)。3次納濾后，多肽回收率為(97.76±0.21)%，芝麻多肽基本都保留在截留液中，這表明胰蛋白酶酶解芝麻蛋白主要形成2肽以上的多肽。

表1 芝麻蛋白酶解液的納濾脫鹽/%

注：表中同一列中帶有相同小寫(xiě)字母的樣品間在0.05水平上無(wú)顯著差異，余同。

2.2 芝麻抗氧化肽超濾分離

超濾分離芝麻蛋白酶解液所得組分及抗氧化活性見(jiàn)表2。由表2可知，采用超濾純化SPTN得到的5個(gè)組分，抗氧化能力存在顯著差異。低分子組分，如SPTN-I，其抗氧化活性較強(qiáng)，而高分子組分抗氧能力較弱。這與任嬌艷等[18]采用超濾分離草魚(yú)蛋白源抗氧化肽，李華等[19]利用超濾分離黑豆抗氧化肽，王章存等[20]超濾分離小麥抗氧化肽的結(jié)果相一致。這可能是肽鏈較短，空間位阻作用小，內(nèi)部的活性基團(tuán)(巰基、酚羥基)暴露，促進(jìn)于自由基發(fā)生反應(yīng)[21-22]。

2.3 制備液相純化SPTN-I

芝麻抗氧化肽的制備液相圖譜如圖1所示。由圖1可知，采用制備液相分離SPTN-I時(shí)，獲得7個(gè)色譜峰，其中P4、P5、P6、P7完全分離，而P1、P2、P3有重疊。制備液相分離SPTN-I的組成及抗氧化活性見(jiàn)表3，P5的抗氧化活性最高，選擇P5進(jìn)行后續(xù)純化。

圖1 芝麻抗氧化肽的制備液相圖譜

組分分子質(zhì)量范圍/ku組成分例/%DPPH清除能力IC50/mg/mLABTS清除能力IC50/mg/mLFRAP/μmol/mgSPTN-I<337.56±0.216.95±0.07f5.87±0.13f1.97±0.02bSPTN-II3～518.31±0.077.54±0.11e7.09±0.21e2.05±0.03aSPTN-Ⅲ5～812.70±0.1311.62±0.19d9.87±0.16d1.49±0.07cSPTN-Ⅳ8～1010.69±0.1814.85±0.25b11.93±0.09b0.99±0.04eSPTN-Ⅴ>1020.74±0.1517.33±0.06a14.78±0.25a0.75±0.07fSPTN——12.80±0.28c10.61±0.09c1.16±0.05d

表3 制備液相分離SPTN-I的組成及抗氧化活性

2.4 抗氧化肽結(jié)構(gòu)鑒定與活性驗(yàn)證

通過(guò)高效液相質(zhì)譜聯(lián)用分析SPTN-I中P5組分，該峰里有5個(gè)多肽(見(jiàn)圖2～圖6)，其二級(jí)質(zhì)譜圖m/z分別為888.77、794.02、665.52、870.69、841.57，采用ProtTech’s ProtQuest軟件分析，其芝麻抗氧化肽的序列見(jiàn)表4。5種多肽的分子質(zhì)量胰蛋白酶水解生成芝麻抗氧化肽是12肽至16肽之間，相對(duì)分子質(zhì)量在1 328.7～1 774.8 u之間，QDNANNANQLDPNPR的抗氧化能力最強(qiáng)，ELFFGAG GENPESFFK的抗氧化能力較弱。對(duì)比其他抗氧化肽，芝麻抗氧化肽與從牛蛙蛋白、金槍魚(yú)骨架蛋白的酶解物中得到1 988 u和1 519 u的抗氧化肽相近[23-24]，與從大米蛋白制備的520.77 u抗氧化肽相差較遠(yuǎn)[10]。不同來(lái)源的抗氧化肽相對(duì)分子質(zhì)量相差懸殊的原因：一是原料蛋白的氨基酸組成存在差異，所形成的多肽組成不同，其實(shí)現(xiàn)抗氧化的途徑不同[25]；二是制備抗氧化肽所采用的蛋白酶不同，其形成的多肽大小存在差異。采用胰蛋白酶制備抗氧化肽，由于胰蛋白酶水解位點(diǎn)單一，形成肽段較長(zhǎng)，如吳慧等[26]采用胰蛋白酶水解乳清蛋白制備出LDGNAKPTPEGDLEL和LYEDLKPTPEGPMEL抗氧化肽[26]。

圖2 芝麻抗氧化肽ELFFGAGGENPESFFK質(zhì)譜圖

圖3 芝麻抗氧化肽FESEAGLTEFWDR質(zhì)譜圖

圖4 芝麻抗氧化肽DVANEANQLDLK質(zhì)譜圖

圖5 芝麻抗氧化肽ENIEHTAATHSYNPR質(zhì)譜圖

圖6 芝麻抗氧化肽QDNANNANQLDPNPR質(zhì)譜圖

觀察芝麻抗氧化肽的氨基酸組成時(shí)，發(fā)現(xiàn)：5種多肽的C末端都有堿性氨基酸殘基(賴(lài)氨酸、精氨酸)，N端以酸性氨基酸殘基或酸性氨基酸的酰胺殘基(除FESEAGLTEFWDR)，推測(cè)上述氨基酸因其側(cè)鏈有氨基或羧基，具有螯合金屬離子和作為質(zhì)子供體的作用，從而提高多肽的抗氧化肽能力[27]。文獻(xiàn)

表4 芝麻抗氧化肽的序列、分子量和抗氧化能力

表5 芝麻抗氧化肽的來(lái)源蛋白

報(bào)道酪氨酸、組氨酸、色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、賴(lài)氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等對(duì)肽的抗氧化性有貢獻(xiàn)[28-30]，除甲硫氨酸和半胱氨酸未在芝麻抗氧化肽中發(fā)現(xiàn)，其余氨基酸均存在與抗氧化肽中，其中天冬氨酸殘基5個(gè)、苯丙氨酸殘基6個(gè)，谷氨酸殘基9個(gè)，估計(jì)這些氨基酸的存在對(duì)芝麻多肽的抗氧化活性起了作用。

采用Protein information resource (PIR)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索多肽序列發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表5)：芝麻抗氧化肽有4種來(lái)源于芝麻11S球蛋白，1種來(lái)源于芝麻7S球蛋白。胰蛋白酶水解芝麻11S蛋白，可以從肽段中63～75、167～181、188～199、320～334位點(diǎn)產(chǎn)生抗氧化肽。同時(shí)，芝麻11S蛋白也是芝麻蛋白的主體，占芝麻蛋白的60%[31-32]，這預(yù)示芝麻11S球蛋白在制備芝麻抗氧化肽過(guò)程中起主導(dǎo)作用。因此，高11S蛋白的芝麻品種適宜于芝麻抗氧化肽的制備。

3 結(jié)論

采用納濾脫鹽、超濾分離、制備液相純化可以有效分離純化胰蛋白酶酶解芝麻蛋白形成的抗氧化肽，采用Nano-LC-ESI-MS/MS分析5種芝麻抗氧化肽結(jié)構(gòu)。

由納濾與超濾實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，胰蛋白酶水解芝麻蛋白形成的多肽，分子量較高，其中<3 ku的組分具有最高的抗氧化活性。

5種芝麻抗氧化肽依次為12肽DVANEANQLDLK、13肽FESEAGLTEFWDR、15肽ENIEHTAATHSYNPR、15肽QDNANNANQLDPNPR、16肽ELFFGAGGENPESFFK，分子質(zhì)量分別是1 328.7、1 585.7、1 738.8、1 679.8、1 774.8 u。多肽的N端以酸性氨基酸殘基為主，C末端為堿性氨基酸殘基。

芝麻11S蛋白在抗氧化肽的形成過(guò)程中起到主導(dǎo)作用，胰蛋白酶水解芝麻11S蛋白可以產(chǎn)生4種抗氧化肽。